M-112木霉固态发酵羊胃容物产木聚糖酶的条件优化

徐 枫 王和平 孙庆林 张雄杰 宋 敏

M-112木霉固态发酵羊胃容物产木聚糖酶的条件优化

徐 枫 王和平 孙庆林 张雄杰 宋 敏

通过研究培养基料比、固液比、无机盐、接种量以及培养时间等单因素对M-112木霉固态发酵羊胃容物的影响，并采用正交实验设计优化了固态发酵条件。研究表明，M-112木霉固态发酵羊胃容物产木聚糖酶是可行的，影响产酶最主要的因素为接种量。优化的发酵条件为胃容物50%，玉米：麦麸=5：5，CaCl2浓度0.5%，初始pH值5.0，固液比1：3，每10 g干培养基接种量2 ml（孢子数1.2～1.6×108cfu/ml），发酵时间72 h,发酵温度30℃。经优化后的酶活水平达到了138.504 IU/ml。较已报道的同种木霉的最高发酵酶活提高达3倍左右。

生物废弃物；低碳经济；羊胃容物；木霉；木聚糖酶；固态发酵

内蒙古有着丰富的牛羊资源，每年屠宰量巨大， 在屠宰牛羊的同时，会产生大量牛羊胃容物。据统计，每头（只）成年牛羊屠宰后可产生0.5～1.5 kg风干瘤胃容物。反刍动物瘤胃容物是有待开发的可利用资源,其中含粗蛋白15.2%、粗纤维26.4%、粗脂肪6.2%、粗灰分12.1%、无氮浸出物40.1%、钙0.71%、磷0.67%[1]。而且，其中还含有生物学价值很高的微生物菌体蛋白、维生素和各种消化酶，尤其富含维生素B12。目前胃容物作为垃圾处理，污染环境、滋生蚊蝇、产生恶臭。如何科学利用它们，设法变废为宝，为科技人员提出了一项低碳经济研究的课题。

木霉（Trichoderma）可产木聚糖酶等，对纤维素、半纤维素类物质有较好的降解能力[2]。木聚糖酶能降解木聚糖中的 β-1，4糖苷键，去除小麦、黑麦、燕麦等谷物饲料中的抗营养因子，改善动物生产性能，补充内源酶分泌的不足，促进养分的消化和吸收，提高饲料利用率，减轻粪便对环境的污染，同时还可开发非常规谷物资源[3]。

本文通过单因素以及正交实验，研究木霉固态发酵羊胃容物产木聚糖酶的最佳发酵条件，设法尽可能多地利用目前屠宰后的胃容物垃圾，其研究结果可为放大木霉固态发酵羊胃容物产木聚糖酶的最佳发酵工艺条件提供可靠的参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品

木聚糖 （Xylan/Sigma）、木糖 （Xylose/Merck）、3,5-二硝基水杨酸 （均为化学纯）；（NH4）2SO4、葡萄糖、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、甘氨酸、酒石酸钾钠、结晶酚、无水乙醇、冰醋酸、无水乙酸钠、FeSO4、KCl、ZnSO4、NaCl、MnSO4、BaCl2、MgCl2、CaCl2、CuSO4（ 均 为 分 析纯）；无菌去离子水、琼脂、麦麸、玉米粉。

1.1.2 仪器

高速冷冻离心机（HITACHI SCR20BC）、恒温培养箱（上海福玛）、电热恒温鼓风干燥箱（上海新苗）、高压灭菌锅（TOMY SX-500）、恒温水浴锅（天津华北HHS）、磁力搅拌器、精密pH计（雷磁 PHS-3B）、电子精密天平 （OHAUS AR2140）、TU-1800型紫外分光光度计（北京普析TU-1800PC）、光学显微镜（Olympus C011）等。

三角瓶（100 ml、250 m）l、烧杯（50 ml、100ml、200ml、500 ml、1 000 m）l、容量瓶（50 ml、100 ml、200 ml、500 ml、1 000 ml）、培养皿（Φ80 mm）、血细胞计数板、盖玻片、无菌毛细滴管等。

封口膜、接种针、移液器（1 ml、2 ml、5 ml）等。

1.1.3 菌种

M-112木霉（M-112Trichoderma）由本研究室提供。

1.1.4 羊胃容物

采自呼和浩特市某屠宰场，湿物料经高压灭菌，风（烘）干，粉碎，过40目筛后，置于干燥器中备用。

1.1.5 培养基

1.1.5.1 传代培养基[马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基]

马铃薯 200 g、葡萄糖 20 g、琼脂 20 g、蒸馏水1 000 ml，pH 值 7.0～7.2。121 ℃高压灭菌 20 min，分装备用。

1.1.5.2 基本固体培养基（麦麸、玉米）

麦麸 250 g、玉米粉 250 g、FeSO40.1%、去离子水1 500 ml,混匀，121℃高压灭菌40 min，备用。

1.1.6 溶液

1.1.6.1 0.2 mol/l pH值5.8乙酸钠缓冲液

溶液A:量取冰乙酸11.80 ml，用去离子水定容至1 000 ml，混匀后备用。

溶液B:准确称取1.642 g乙酸钠（无水），用少量去离子水溶解后定容至100 ml，混匀后备用。

0.2 mol/l pH值5.8乙酸钠缓冲液：取A液940 ml、B液60 ml，混匀即成。

1.1.6.2 1%木聚糖（Xylan）溶液

准确称取木聚糖（Xylan）1.00 g，用少量0.2 mol/l pH值5.8乙酸钠缓冲液溶解后定容至100 ml，混匀即成（4℃冷藏备用）。

1.1.6.3 DNS（3,5-二硝基水杨酸）溶液

准确称取3,5-二硝基水杨酸 6.30 g于500 ml烧杯中，用少量去离子水溶解后，加入2 mol/l NaOH溶液260 ml，然后移加到500 ml含有18.5 g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5 g结晶酚和5 g无水亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后移入1 000 ml容量瓶中定容至1 000 ml，充分混匀，贮存于棕色瓶中，室温放置一周后使用。

1.1.6.4 1 mg/ml标准木糖（Xylose）溶液

标准称取木糖（Xylose）50.0 mg，用少量去离子水溶解，然后加1 mg叠氮化钠（防腐），再用去离子水定容至50 ml，混匀即成（4℃冷藏备用）。

1.2 方法

1.2.1 木糖标准曲线的绘制

图1 木糖标准曲线

将木糖标准溶液制成如图1所示的浓度梯度，用DNS法测定（OD550）木糖含量。以木糖浓度梯度为纵坐标，木糖浓度梯度对应的吸光度值（OD550）为横坐标，使用软件origin7.5进行线性拟合[4]，建立木糖标准曲线，得到回归方程y=0.865 9x+0.113 4，R2=0.997 2。

1.2.2 木聚糖酶的活性测定

1.2.2.1 粗酶液的制备

取固态发酵物，按1：5加入0.2 mol/l pH值5.8的乙酸钠缓冲液，充分搅拌，将发酵物混匀，40℃水浴加热1 h，取提取液5 ml,经4 200 r/min，4℃下离心10 min,取清液，用醋酸钠缓冲液稀释10倍，即为粗酶液。

1.2.2.2 木聚糖酶的活性测定（DNS法）

在试管（做三个平行）中加粗酶液0.1 ml，0.2 mol/l pH值5.8醋酸缓冲液5.5 ml，1%木聚糖溶液0.9 ml，摇匀，50℃水浴30 min（准确）。酶解完毕后取出，加DNS试剂1 ml摇匀，立即沸水浴加热10 min，冷却后，于550 nm下测OD值。由回归方程及酶活定义计算酶活性。

空白管，不加底物，即用0.2 mol/l pH值5.8醋酸缓冲液代替1%木聚糖溶液加入的量，其他与待测样管相同。

木聚糖酶活力单位定义：在最适条件下，每分钟分解10 mg/ml木聚糖溶液产生1 μmol还原糖（木糖）的酶量,定义为一个木聚糖酶活力单位（U/ml）。

式中：A——所测吸光度值在标准曲线上对应的还原糖（木糖）量（mg），即用该回归方程所计算的值；

B——酶液的稀释倍数；

30——酶促反应的时间（min）；

10——测定所用的0.1 ml酶液折算成1 ml酶液的换算值；

1 000——毫克还原糖（木糖）单位折算成微克还原糖（木糖）单位的换算值；

150.14——木糖（Xylose）的相对分子质量。

1.2.3 M-112木霉固态发酵羊胃容物产木聚糖酶的条件优化

1.2.3.1 固态发酵条件的单因素实验研究

①羊胃容物固态培养基接种量实验

调整接种悬液孢子数为1.2～1.6×108cfu/ml。设置接种量梯度（10 g干培养基），1、2、3、4、5 ml,共 5 个处理，每个处理3个重复，羊胃容物添加量为50%，固液比为1：3，30℃下培养72 h；制备粗酶液；DNS法测定木聚糖酶活性。结果图示为均值与标准偏差。

②羊胃容物固态培养基固液比实验

设置固液比梯度（10g干培养基/100ml三角瓶中），1：1、1：1.5、1：2、1：2.5、1：3、1：3.5、1：4、1：4.5、1：5，共9个处理，每个处理3个重复,羊胃容物添加量为50%，每10 g干培养基接种量为3 m（l1.2～1.6×108cfu/ml），30℃下培养72 h；制备粗酶液；DNS法测定木聚糖酶活性。结果图示为均值与标准偏差。

③羊胃容物与基本固体培养基比例实验

羊胃容物与基本固体培养基之比分别为2：8、3：7、4：6、5：5、6：4、7：3、8：2，共 7 个处理，每个处理3个重复，每10 g干培养基接种量为3 m（l1.2～1.6×108cfu/ml），固液比为 1：3，30 ℃下培养 72 h；制备粗酶液；DNS法测定木聚糖酶活性。结果图示为均值与标准偏差。

④羊胃容物固态培养基添加无机盐实验

在设定培养基中，分别添加0.1%的无机盐（Ca2+、K+、Fe2+、Zn2+、Cu2+、Mg2+、Ba2+、Na+、Mn2+），共 9 个处理，每个处理3个重复，羊胃容物添加量为50%，固液比为1：3，每10g干培养基接种量为3 m（l1.2～1.6×108cfu/m）l，30℃下培养72 h；制备粗酶液；DNS法测定木聚糖酶活性。结果图示为均值与标准偏差。

1.2.3.2 固态发酵条件的正交实验研究

在以上单因素实验研究的基础上，进行5因素5水平的正交实验。

2 结果与分析

2.1 不同单因素对M-112木霉固态发酵羊胃容物产木聚糖酶的影响

2.1.1 接种量对M-112木霉固态发酵羊胃容物产木聚糖酶的影响

图2 接种量对木聚糖酶活力的影响

通过 5 个接种量（1、2、3、4、5 ml）的实验，其研究结果表明（见图2），3 ml的接菌量（1.2～1.6×108cfu/m）l，使该M-112木霉固态发酵羊胃容物产生的木聚糖酶较多。

一般微生物发酵速度的快慢，常取决于接种量的多少。接种量大，有利于基质的利用，可以缩短发酵环境中菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物合成提前到来，并且生产菌迅速占据整个培养环境，可减少杂菌生长的机会。但是，接种量过多，往往使菌丝生长过快，培养液黏度增加，则造成溶解氧不足而影响产物的合成。接种量过小，则除了延长发酵周期之外，往往还会引起其它不正常的情况[5]。较为合适的接种量，则会提升产物合成的水平。

2.1.2 固液比对M-112木霉固态发酵羊胃容物产木聚糖酶的影响（见图3）

图3 固液比对木聚糖酶活力的影响

通 过 9 个 固 液 比（1：1、1：1.5、1：2、1：2.5、1：3、1：3.5、1：4、1：4.5、1：5）的实验，其研究结果表明，固液比为1：3时，使该M-112木霉固态发酵羊胃容物产生的木聚糖酶较多。

水是微生物生长代谢必不可少的物质,也是发酵的主要媒介,因而培养基中含水量的变化必然对微生物的生长及代谢能力产生重要影响。固液比较大，会造成物料含水量较低，而导致物料膨胀程度低，并在发酵后期由于蒸发作用使物料干化，从而抑制菌体生长，而造成产物产量降低。固液比较小，则含水量较高，会使物料多孔性降低,减少了物料内气体交换、通风和降温,不利于木霉的菌体生长和对培养基中木聚糖的降解[6]。

2.1.3 胃容物与基本固体培养基比例对M-112木霉固态发酵羊胃容物产木聚糖酶的影响（见图4）

图4 胃容物添加量对木聚糖酶活力的影响

通过7个羊胃容物与基本固体培养基之比（2：8、3：7、4：6、5：5、6：4、7：3、8：2）的实验，其研究结果表明，羊胃容物与基本固体培养基之比为5：5时，使该M-112木霉固态发酵羊胃容物产生的木聚糖酶较多。

羊胃容物含有蛋白和纤维素以及种类丰富的无机盐等，但是也含有一些抑制木霉发酵的因素。通过控制羊胃容物加入量，一方面尽可能多的利用羊胃容物，另一方面使其产木聚糖酶尽可能的多。

2.1.4 无机盐离子对M-112木霉固态发酵羊胃容物产木聚糖酶的影响（见图5）

通过分别添加9种不同无机盐离子（K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+、Mn2+、Ba2+）的实验，其研究结果表明，所选的这些离子都具有促进M-112木霉固态发酵羊胃容物产木聚糖酶的作用，但Ca2+的促进作用最大。

图5 无机盐离子对木聚糖酶活力的影响

微生物生长过程中需要某些无机盐和微量元素，调节渗透压和透性、稳定环境pH值、构成生物物质、生理调节、促进菌丝体的增殖等[7-8]。这些物质一般在低浓度时对微生物生长和产物合成具有促进作用，在高浓度时常表现出明显的抑制作用。

2.2 M-112木霉固态发酵羊胃容物的正交实验研究

采用L25（55）正交设计法进行5因素5水平正交实验[9]，其研究结果表明（如表1、效应曲线图6所示），M-112木霉固态发酵羊胃容物产木聚糖酶的优化条件为A3B1C2D5E2,其酶活达到138.504 IU/ml。

由极差分析可知，在M-112木霉固态发酵羊胃容物的过程中，各因素对发酵产木聚糖酶活性的影响程度有所不同，其影响程度由大到小顺序依次为：接种量＞发酵时间＞玉米与麦麸比例＞无机盐浓度＞初始pH值。接种量与发酵时间是M-112木霉固态发酵羊胃容物产木聚糖酶生产工艺中最主要的影响因素，只有控制最合适的接种量和发酵时间才能产生更多的木聚糖酶。初始pH值对羊胃容物固态发酵的影响较小，说明M-112木霉固态发酵羊胃容物对pH值变化具有一定的自我调节和适应能力。

表1 正交实验结果

图6 效应曲线

3 结论

通过培养基料比、固液比、无机盐、接种量、培养时间等单因素以及正交实验对M-112木霉固态发酵羊胃容物产木聚糖酶的影响研究，其优化条件为：胃容物 50%、玉米：麦麸=5：5、无机盐（CaCl2）浓度0.5%、初始pH值5.0、固液比 1：3，每10 g干培养基接种量 2 ml（孢子总数 1.2～1.6×108cfu/ml），发酵时间72 h,发酵温度30℃，M-112木霉固态发酵羊胃容物产生的木聚糖酶活性可达到138.504 IU/ml，较已报道的同种木霉的最高发酵酶活提高达3倍以上[10]，证明M-112木霉固态发酵羊胃容物产木聚糖酶是可行的。实验为放大M-112木霉固态发酵羊胃容物产木聚糖酶的最佳发酵工艺条件，设法尽可能多的利用目前屠宰后的胃容物垃圾变废为宝（低碳经济利用）提供了可靠的参考数据。

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TQ920.6

A

1001-991X（2011）04-0020-05

徐枫，内蒙古农业大学生命科学学院，010018，呼和浩特。

王和平（通讯作者）、孙庆林、张雄杰、宋敏，单位及通讯地址同第一作者。

2010-10-19

国家自然科学基金项目（39870558）

（编辑：高 雁，snowyan78@163.com）