蛋白酶体抑制剂MG132抑制体外培养心肌细胞肥大的实验研究

朱静雯,陈保林,马跃东,刘 晨,4

(贵州省人民医院:1.干医科;2.心内科,贵阳 550002;中山大学:3.附属第一医院心血管医学部;4.卫生部辅助循环重点实验室,广州 510080)

蛋白酶体抑制剂MG132抑制体外培养心肌细胞肥大的实验研究

朱静雯1,陈保林2△,马跃东3,刘 晨3,4

(贵州省人民医院:1.干医科;2.心内科,贵阳 550002;中山大学:3.附属第一医院心血管医学部;4.卫生部辅助循环重点实验室,广州 510080)

目的研究蛋白酶体抑制剂MG132对体外培养的大鼠心肌细胞肥大的影响。方法采用[3H]-亮氨酸参入率测定心肌细胞蛋白质合成代谢,采用IPP 6.0图像分析软件分析心肌细胞表面积,以及用 RT-PCR检测β-肌球蛋白重链(β-M HC)表达。结果MG132预处理逆转了苯肾上腺素诱导的心肌细胞[3H]-亮氨酸参入率增加(P＜0.01)、表面积增大(P＜0.01)和β-MHC mRNA表达上调(P＜0.05)。结论MG132能够抑制心肌细胞肥大,具有心肌保护作用。

心肌细胞;肥大;蛋白酶体;β-肌球蛋白重链

心肌肥厚是心肌细胞对机械张力以及各种刺激的重塑反应,然而持续的肥厚显著增加恶性心律失常、心源性猝死和心力衰竭发生的风险[1]。蛋白酶体是一种广泛存在于真核细胞中具有蛋白水解作用的大分子复合物,催化细胞内大约80%的蛋白质降解,对维持细胞结构和功能的稳定起了重要作用[2-3]。以往的研究表明,蛋白酶体功能异常与一些心血管疾病,如动脉粥样硬化、心肌缺血-再灌注损伤、心功能衰竭,以及家族肥厚性心肌病等的发病机制有关联。近年来有报道显示,特异性蛋白酶体抑制剂MG132(Z-Leu-Leu-Leu-aldehyde)通过抑制蛋白酶体活性能够抑制细胞增生,并具有抗炎、抗凋亡[4]、抗肿瘤等活性[4-5]。蛋白酶体抑制剂已成为抗肿瘤药物治疗的研究热点,但其在心肌细胞肥大中的作用尚不明确。本研究通过苯肾上腺素(PE)诱导体外培养的原代心肌细胞肥大,旨在观察MG132对心室重构的可能保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料 出生1～3 d的SD大鼠(清洁级),由中山大学实验动物中心提供。DMEM/F12培养基、Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶、胎牛血清均购于美国Gibco公司,Brdu购于美国Sigma公司,MG132购于美国Alexis公司,蛋白酶体活性检测试剂盒购于Promega公司,[3H]-亮氨酸由北京原子能研究所提供,随机引物、dNTP、M-MLV、PCR mix购于 TaKaRa公司,T rizol购于Invitrogen公司,PCR引物由Invitrogen公司合成。

1.2 原代心肌细胞分离与培养 无菌条件下开胸取出完整心脏,浸于 D-Hank′s液中,冲去血污。在超净台内,去除心底结缔组织和心房,剪开心室,将心室心肌组织剪碎成1 mm3大小,以0.05%Ⅰ型胶原酶消化,37℃恒温槽轻轻振荡2 h,之后以5倍于组织碎块体积的0.125%胰酶消化2～3次,每次5 min,直至不见细胞团块。收集细胞悬液至含10%胎牛血清的培养基中,以200目筛网过滤后接种至培养瓶,置于37℃、5%CO2培养箱内60 min,用差时贴壁法去除成纤维细胞。心肌细胞以5×105/mL的密度接种于6孔板,加0.1 mmol/L 5-BrdU以抑制成纤维细胞生长,加入青霉素及链霉素各100 U/mL防止细菌污染。培养48 h后细胞生长融合成片,并出现同步收缩,换成无血清的培养基,饥饿24 h后进行分组干预。

1.3 蛋白酶体活性检测 加入 MG132(0.1、1.0、10.0 μ mol/L)干预6 h,提取蛋白并定量,按蛋白酶体活性检测试剂盒说明书 操作,取 10 μ g 样品和 10 μ L 的 Suv-Leu-Leu-Val-Try-AMC,再加入反应缓冲液使反应体系为 100 μ L,37℃下孵育30 min,荧光分光光度计(波长380 nm)测量吸光度值。然后根据对蛋白酶体活性抑制的效果选择合适的MG132剂量用于对心肌肥大的进一步研究。

1.4 实验分组 分为对照组、1 μ mol/L MG132组(MG 组)、10 μ mol/L 苯肾上腺素组(PE 组)、10 μ mol/L 苯肾上腺素(PE)+1 μ mol/L MG132组(MG+PE组)。MG132于 PE刺激前30 min干预。

1.5 [3H]-亮氨酸参入率测定心肌细胞蛋白质合成 细胞分组干预后同时将终浓度为 1 μ Ci/mL的[3H]-亮氨酸加入细胞中,继续培养24 h后收集细胞裂解液并转移至闪烁瓶中,加入闪烁液,用液体闪烁计数仪测定每分钟脉冲数(CPM),以CPM/106cell表示[3H]-亮氨酸参入率。以对照组细胞[3H]-亮氨酸参入率作 100%,各组[3H]-亮氨酸参入率以百分率表示。

1.6 心肌细胞的表面积测定 细胞干预48 h后以IPP 6.0图像处理系统摄像,各组随机选取4次实验的边界清晰的细胞,测量100个细胞的表面积,以IPP 6.0图像分析软件分析结果。

1.7 心肌细胞β-肌球蛋白重链(β-M HC)mRNA 表达的测定用Trizol试剂提取细胞总 RNA,取 1 μ g RNA为模板。按照 RT-PCR试剂盒说明书操作。β-M HC引物:上游 5′-CAA CAC CAA CCT GTC CAA GTT C-3′,下 游 5′-TGC AAA GGC TCC AGG TCT GAG G-3′,扩增片段大小为 204 bp;βactin 引物:上游 5′-GGA AAT CGT GCG TGA C-3′,下 游 5′-GGA AGG TGG ACA GTG AG-3′,扩增片段大小为 440 bp。PCR反应条件:94℃预变性3 min,95℃变性45 s,55℃退火40 s,72℃延伸 1 min,共30个循环,最后72℃延伸5 min。产物在质量浓度为1.5%的琼脂糖凝胶上电泳,用Image J软件进行分析,结果以各目的条带的灰度值与相应内参β-actin灰度比值表示。

2 结 果

2.1 MG132对心肌细胞蛋白酶体活性影响 同剂量MG132(0.1、1.0、10.0 μ mol/L)呈浓度依赖性的抑制蛋白酶体活性,以10 μ mol/L浓度对蛋白酶体活性抑制最明显(P＜0.01)。提示MG132能够有效抑制体外培养心肌细胞的蛋白酶体活性。

图1 各组心肌细胞[3H]-亮氨酸参入率比较

2.2 MG132对苯肾上腺素诱导的心肌细胞[3H]-亮氨酸参入率增加的影响 各组心肌细胞[3H]-亮氨酸参入率见图1,MG132对正常心肌细胞[3H]-亮氨酸参入率无影响,与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。PE组[3H]-亮氨酸参入率明显增加,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。而MG132预处理能明显抑制PE所引起的心肌细胞[3H]-亮氨酸参入率增加,MG+PE组与PE组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。

2.3 MG132对苯肾上腺素诱导的心肌细胞表面积增大的影响 各组心肌细胞表面积见图2,MG132不影响正常心肌细胞表面积,与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。PE组心肌细胞表面积增大,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。而MG132预处理能明显抑制苯肾上腺素所引起的心肌细胞表面积增大,MG+PE组与PE组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。

图2 各组心肌细胞表面积比较

2.4 心肌细胞β-M HC mRNA表达的测定 RT-PCR检测结果见图3,MG132对正常心肌细胞β-M HC mRNA表达无影响,与对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。PE刺激心肌细胞后β-MHC mRNA表达增加,PE组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。MG132能明显抑制苯肾上腺素诱导的β-MHC mRNA表达,MG+PE组与PE组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。

图3 RT-PCR检测β-MHC mRNA表达结果

3 讨 论

心肌肥大是高血压、心瓣膜病等心血管疾病的常见并发症,是心脑血管事件的独立危险因素。当前的临床药物治疗对改善心肌肥大有一定的作用,但效果并不理想。蛋白酶体是一种具有多种蛋白水解功能的大分子复合物,在泛素-蛋白酶体通路介导的蛋白质降解中起催化作用。蛋白酶体沉降系数为26 S,称为26 S蛋白酶体,由一个20 S亚单位及2个19 S亚单位组成[3]。蛋白酶体不仅通过降解清除损伤的和错误折叠的细胞蛋白质,还通过影响一些特殊功能蛋白和调控细胞内信号蛋白从而实现对细胞周期增殖、凋亡、免疫应答以及基因转录的调控[6-8],对维持心肌细胞结构和功能的稳定乃至整个生物体的正常功能发挥起了重要的作用。随着研究的深入,蛋白酶体已成为一个药物开发研究的理想靶点受到人们的广泛关注。蛋白酶体包含多种蛋白酶活性,主要有糜蛋白酶活性、胰蛋白酶活性以及后谷氨酰肽水解酶活性等[9]。糜蛋白酶活性最常被用来检测细胞和组织中的蛋白酶体活性,并且糜蛋白酶作用底物被认为是最具蛋白酶作用特异性的。Depre等[10]在压力过负荷诱导的心肌肥厚模型中发现,肥大心肌细胞糜蛋白酶样蛋白酶体活性是正常对照组的两倍,认为蛋白酶体活性增高参与了心肌细胞肥大的形成。近年来的研究表明,蛋白酶体抑制剂通过抑制蛋白酶体活性,能够影响细胞因子、生长因子和信号分子的表达,进而干扰细胞增殖、分化、凋亡过程[11-13]。MG132是最早被发现和广泛应用的醛肽类蛋白酶体抑制剂,能直接作用于20 S蛋白酶体的活性位点发挥生物学作用,具有较高的活性和选择性[5,9],在心肌细胞中能抑制多种蛋白酶体亚型的活性而不影响细胞正常的生物学功能[8-9]。尽管研究已经显示MG132对心肌细胞具有抗氧化应激[14]、抗动脉粥样硬化、预防动脉再狭窄[11],以及能够诱导心肌细胞多种热休克蛋白表达提供心肌保护作用[14-15],但其对心肌肥大的作用仍不清楚。

本研究发现MG132预处理能够有效抑制糜蛋白酶样蛋白酶体活性,在本研究使用的剂量范围内呈一定程度的浓度依赖性,而更大剂量的MG132则有可能产生细胞毒性[16]。本研究进一步应用PE刺激原代培养的新生大鼠心肌细胞,构建心肌细胞肥大模型,并观察蛋白酶体抑制剂MG132对心肌细胞的保护作用。在细胞水平,心肌细胞肥大表现为细胞蛋白质合成增加、体积增大和胚胎基因再表达。本研究结果显示,MG132对正常心肌细胞[3H]-亮氨酸参入率、表面积以及胚胎基因β-MHC mRNA表达量无影响,但可明显抑制PE诱导的心肌细胞蛋白质合成增加、表面积增大和β-MHC mRNA表达增加,提示蛋白酶体可能参与心肌细胞肥大的发生、发展。正常情况下,细胞内蛋白质处于一个持续降解和再合成的动态过程,细胞内促肥大因子与肥大抑制因子间的相互作用决定了细胞是否向着肥大方向发展[17]。有报道表明蛋白酶体活性增加能够促进心肌细胞中肥大抑制因子的降解[10],使得促肥大因子相对占优势,导致心肌细胞肥大。因此,MG132有可能通过抑制蛋白酶体活性从而调控心肌细胞肥大信号通路发挥抑制心肌肥大作用,其具体的分子机制仍有待进一步明确。

总之,蛋白酶体抑制剂MG132能够有效抑制PE介导的心肌细胞肥大,为心肌肥大的治疗提供了新思路。然而,需要进一步在体的实验研究评价其对心肌细胞长期作用的有效性、安全性,以及最佳剂量。

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Proteasome inhibitor MG132 attenuate cardiomyocyte hypertrophy in vitro

Zhu Jingwen1,Chen Baolin2△,Ma Yuedong3,Liu Chen3,4
(1.Department of Geriatrics;2.Department of Cardiology,the People′s Hospital of Guizhou Province,Guiyang,Guizhou 550002,China;3.Department of Cardiology,the First Af filiated Hospital;4.Key Laboratory on Assisted Circalation of Ministry of Health,Sun Yat-Sen University,Guangzhou,Guangdong 510080,China)

ObjectiveTo investigate the effects of proteasome inhibitor MG132 on cardiomyocyte hypertrophy in vitro.MethodsCardiomyocyte protein synthesize was determined by measuring the[3H]-Leucine incorporation rate.With the aid of IPP 6.0 Image software,the surface areas of cardiomyocytes was analyzed.The mRNA expression of fetal gene β-myosin heavy chains(β-MHC)was measured by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR).ResultsMG132 significantly inhibited phenylephrine(PE)induced increase in cardiomyocyte[3H]-Leucine incorporation rate(P ＜0.01),surface area(P ＜0.01)and β-M HC mRNA expression(P＜0.05).ConclusionMG132 may inhibite cardiomyocyte hypertrophy,and demonstrate an cardioprotective activity.

cardiomyocyte;hypertrophy;proteasome;β-myosin heary chains

10.3969/j.issn.1671-8348.2011.06.004

A

1671-8348(2011)06-0532-03

△通讯作者,Tel:13890458227;E-mail:chenbl104@126.com。

2010-06-07

2010-10-01)

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