家蝇抗菌物质诱导表达后的电泳分析＊

许兵红,曾莉萍,董卫华

许多昆虫在受到外界诱导时,能迅速产生一些体液免疫因子,如凝集素、溶菌酶、抗菌蛋白及抗菌肽,这些物质主要是抗菌肽对细菌、某些真菌、病毒、原虫有特殊杀伤或抑制作用。目前已有多种昆虫的抗菌基因被诱导表达,研究主要集中在鳞翅目和双翅目昆虫[1-5]。我们对丝光绿蝇(L ucilia sericata)[6-7]和家蝇(Musca domestica)[8-9]的抗菌物质进行诱导表达研究后,又对家蝇抗菌物质诱导表达后的电泳分离进行了探讨,现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 昆虫及饲养 供试验用的家蝇由本实验室室内饲养繁殖,幼虫生长条件为:温度26℃、相对湿度75%,光照采用60w白炽灯12h/d,幼虫饲料各组分比例如下:麦麸600g,鱼粉100g,牛奶粉 40g,酵母粉8g,蛋白胨15g,水1 500mL。

1.2 应试菌种 溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)由本实验室提供,使用前将冻存的菌种复苏,接种到固体培养基上,37℃恒温培养16～18h备用。

1.3 诱导 取室内饲养的家蝇3龄幼虫(幼虫孵出第3d),用2号昆虫针针刺体壁诱导,每虫1针,处理后置于幼虫饲料罐中饲养。

1.4 血淋巴收集 经针刺诱导处理后第48h,收集存活的幼虫,用0～4℃冷水反复冲洗,再用无菌双蒸水冲洗3次,滤纸吸干虫体表面水分,剪去头部收集血淋巴于1.5mL离心管中,10 000r/min(6.64×103g,r=5.94cm)离心10min,取上清液备用,或置于-20℃冰箱保存。

1.5 抑菌活力测定 抑菌活力测定采用平板滤纸片法,滤纸片直径6mm。固体培养基配比如下:蛋白胨 10g、牛肉膏 3g、NaCl 5g、琼脂 20g,加双蒸水至1 000mL,调p H至7.2,每个直径7.5cm培养皿加入12mL培养基制成平板备用。细菌复苏培养后,取培养至对数期细菌配成6×108cells/mL菌液,涂于平板上,将滤纸片加7μL血淋巴样品,37℃培养24h后测量记录抑菌环直径。

1.6 针刺的诱导效果实验 提取家蝇幼虫经针刺诱导48h后的血淋巴,观察记录其对溶壁微球菌的抑菌效果,以未经诱导正常饲养的家蝇幼虫的血淋巴为对照,每组重复3次。

1.7 热处理去杂蛋白效果和去杂蛋白后的抑菌效果实验 提取家蝇诱导后48h的血淋巴,1.5mL离心管加样 200μL,分别置于 100℃水浴 10s、30s、1min、3min、5min、和 80℃水浴 30s、1min、3min、5min处理后,加双蒸水 100μL,混匀后,10 000r/min离心10min去除沉淀,取上清,每组分别取7μL用于平板实验,观察不同温度处理不同时间的去杂蛋白效果和去杂蛋白后对溶壁微球菌的抑菌效果。

1.8 电泳分析 经诱导后 48h的血淋巴,经100℃、80℃水浴热处理不同时间后,取血淋巴离心上清,采用酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),10%分离胶,3%浓缩胶,样品加样20μL,观察各样品的电泳行为。

2 结 果

2.1 针刺的诱导效果 家蝇幼虫经针刺体壁处理后48h,提取的血淋巴对溶壁微球菌有明显的抑菌活性,3次重复的抑菌环直径分别为24、23和23 mm,而对照组亦有抑菌环,但环小,仅为12 mm。

2.2 80℃高温处理后的抑菌效果 见表1。

图1 80℃处理不同时间后对溶壁微球菌的抑菌效果Fig.1 The antibacterial effect of hemolymph after being bathed at 80℃againstM.lysodeikticus

表1 80℃处理不同时间后对溶壁微球菌的抑菌环直径(mm)Table 1 The antibacterial ring diameters(in mm)of hemolymph after being bathed at 80℃againstM.lysodeikticus

2.3 100℃高温处理后的抑菌效果 见表2。

表2 100℃处理不同时间后对溶壁微球菌的抑菌环直径(mm)Table 2 The antibacterial ring diameters(in mm)of hemolymph after being bathed at 100℃againstM.lysodeikticus

图2 100℃处理不同时间后对溶壁微球菌的抑菌效果Fig.2 The antibacterial effect of hemolymph after being bathed at 100℃againstM.lysodeikticus

2.4 电泳分析 见图3。

3 讨 论

昆虫抗菌基因的表达产物有溶菌酶、抗菌蛋白和抗菌肽,其中,溶菌酶和抗菌蛋白只起辅助作用,抗菌肽是主要的抗菌物质,对家蝇抗菌物质的诱导虽有较多的报道,但经加热处理后去除变性蛋白后的抑菌活性以及电泳分析尚未见报道。

图3 电泳图谱Fig.3 Polyacrylamide gel electrophoresis1:80℃30s;2:1min;3:3min;4:5min;5:100℃5min;6:3min;7:1min;8:30s;9:10s

实验结果表明,家蝇幼虫经针刺诱导后,其血淋巴对溶壁微球菌有明显的抑菌环产生,对照组对溶壁微球菌虽然也有抑菌环产生,但明显小于诱导组。提示针刺体壁可诱导家蝇幼虫体内产生抗菌物质。

家蝇幼虫血淋巴含大量的蛋白成分,需进行预处理去除杂蛋白才易于分离,本实验采用了热处理使蛋白变性离心去除的方法。100℃处理血淋巴时,经30s即变性,处理30s～5min等不同的时间后,离心可去掉大量的蛋白沉淀,且随处理时间延长,离心去掉的变性蛋白增多。100℃水浴30s、1min后,其上清对溶壁微球菌仍有抗菌活性,100℃处理3min和5min后观察不到明显的抑菌环,可见100℃处理时抗菌活性丧失较快,可能抗菌肽也随之变性被离心去掉。80℃水浴30s后血淋巴并没有蛋白变性发生,水浴1min后开始有蛋白变性发生,离心可去掉变性蛋白,水浴3min和5min后蛋白变性明显,离心可去掉大量的变性蛋白。且经80℃处理不同时间的上清均有明显的抑菌活性,随处理时间的延长,抗菌活性丧失较慢。可见,抗菌肽诱导表达后提取的血淋巴,采用80℃处理30s,离心不能去除其血淋巴中的杂蛋白,虽然其上清抑菌活性强,但电泳时由于血淋巴蛋白太多,分离效果不明显(图3中第1电泳道)。采用80℃处理1min左右后离心可去除大量的血淋巴杂蛋白,而且上清的抑菌活性保持较好,电泳分离效果比较清晰(图3中第2电泳道)。采用80℃处理3min和5min后离心可去除更多的血淋巴杂蛋白,但上清的抑菌活性明显减弱(表2)。提示纯化前血淋巴预处理宜采用80℃水浴1min后离心去掉变性蛋白的方法。经100℃水浴热处理3min和5min的血淋巴上清与其他7个热处理样品在蛋白电泳区带上也有明显的差异,100℃处理3min和5min的血淋巴上清对溶壁微球菌无明显的抑菌环产生,电泳图谱也比其他处理组少2个明显的区带,此2条差异区带可能为抗菌肽组份。

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