MICA新等位基因MICA＊002:04的DNA序列鉴定及分析①

谭 茵 黄颖烽 徐秀章 叶 欣 魏亚明 古维立

(广州医学院基础学院,广州510182)

主要组织相容性复合体Ⅰ类链相关蛋白A(Major histocompatibility complex classⅠchain-related protein A,MICA)是位于人类第六号染色体短臂6p21.31位置全长11 772 bp,编码1 382 bp的转录子,含383个氨基酸残基[1]。MIC基因家族又称PerB11,它包括 MICA、MICB、MICC、MICD、MICE、MICF 和 MICG七个成员,其中只有MICA、MICB具有编码、表达、转录蛋白的功能[2]。

MICA基因具有高度的多态性,含有6个外显子,目前检测出约72个MICA等位基因,分别命名为 MICA001-053。MICA007包括 00701-00703,MICA008为00801-00804,MICA002091218各有两个等位基因[3]。不同种族、地区、人群中,MICA等位基因存在遗传异质性,亚洲人群中常见MICA等位基因是 MICA002、004、008、010、017 和 MI-CA049[6],另外在MICA外显子5微卫星(GCT)的重复数目发现了5个等位基因,分别命名为A4、A5、A5.1、A6、A9,广州地区汉族最常见的等位基因是A5[4]。

近年来,随着对肿瘤研究的深入,MICA基因多态性与肿瘤的关系越来越受到重视,文献报道MICA9等位基因提示胃癌高风险,MICA6等位基因提示口腔麟状细胞癌高风险,MICA A5.1等位基因与非黑色素瘤皮肤癌不相关[5-7]。

本文报道在广东地区人群中恶性肿瘤病人MICA基因与疾病相关性研究中,发现一例广东籍肺癌病人标本在MICA＊002位置出现基因突变,与世界通用MICA数据库已有序列不相符,对其分别进行外显子2～5双向测序及MICA-PCR DNA片段克隆测序,发现一个MICA新等位基因系列。该基因被世界卫生组织HLA命名委员会正式命名为MICA＊002 ：04。

1 材料与方法

1.1研究对象 课题组于2009～2010年收集肿瘤病人384例标本进行分析和调查,男性218例,女性166例。所有病人标本均经过组织活检及病理结果检测确定为恶性肿瘤。新等位基因源自一例肺癌病人,男性,53岁,汉族,广东籍贯。

1.2仪器与试剂 全血DNA提取试剂盒及质粒提取试剂盒(德国QIAGEN公司),引物合成(北京六合华大基因科技股份有限公司),LA Taq酶、HF Taq酶、pMD○R20-T Vector(大连宝生物工程有限公司),PCR产物纯化试剂盒(美国 Promega公司),3130型全自动测序仪(美国ABI公司),PCR扩增仪(MJ PTC-200PCR,美国),凝胶成像系统(美国 UVP公司),电泳仪(美国Bio-Rad公司)。

1.3方法

1.3.1基因组DNA提取 病人术前空腹采集5%EDTA抗凝外周全血3毫升,低速(2 000 r/min)离心5分钟,取白膜层,按试剂盒提取染色体组DNA(详细步骤按试剂盒操作说明书),-20℃保存。

1.3.2MICA-PCR扩增 染色体DNA样品用蒸馏水调整DNA浓度为20 ng/ml,进行MICA-PCR扩增,反应体系为30μl,其中反应缓冲液25μl,包括：组特异性引物终浓度0.25μmol/L,HF Taq酶1.0 U;DNA样品5μl。扩增条件为96℃预变性2分钟,96℃变性30秒、69℃退火50秒,72℃延伸90秒,共10个循环,96℃变性30秒、67℃退火60秒,72℃延伸90秒,共20个循环,最后1循环72℃延伸10分钟后冷却至4℃。取扩增后标本10μl,置于2%琼脂糖凝胶中电泳,130伏,约20分钟。UVP凝胶成像系统成像(具体引物序列见表1)。

1.3.3MICA-PCR产物纯化 挑出电泳结果呈阳性条带的MICA-PCR管,每管加入0.6μl PCR产物纯化剂后,放入PCR仪,运行纯化程序。具体条件步骤为37℃30分钟转至80℃15分钟,冷却至4℃。

1.3.4MICA等位基因序列分析

1.3.4.1直接测序法检测MICA等位基因序列 纯化后MICA-PCR产物进行测序分析,反应体系为15 μl,其中纯化后 PCR产物2μl,水4.0μl,测序引物2.0μl,测序反应混合液7.0μl。测序PCR扩增条件96℃预变性1分钟,96℃变性10秒、50℃退火5秒,60℃延伸2分钟,共25个循环。冷却至4℃(具体引物序列见表1)。

1.3.4.2DNA片段克隆法测定MICA等位基因序列 为进一步验证序列准确性,PCR产物经回收纯化,克隆于pMD○R20-T Vector载体,具体操作按说明书,并转化于大肠埃希菌DH5α,进行蓝白斑筛选,挑选出阳性克隆单菌落,37℃振荡培养过夜,提取质粒DNA。再以阳性克隆质粒DNA为模板,进行克隆测序分析,测序引物为质粒载体上启动子引物(具体引物序列见表1)。

1.3.5MICA等位基因分型确定 直接测序及克隆测序所得基因序列均使用SeqMICA Analysis Programme分析软件,比对国际MICA数据库进行序列分析,具体步骤参考仪器及软件操作说明书。

2 结果

图1 MICA-PCR结果Fig.1 MICA-PCR result

2.1 MICA直接测序结果 病人样品编号2213进行MICA-PCR法扩增,经琼脂凝胶电泳,得长度约2 200 bp(图1)的DNA片段;针对该样品等位基因的2～5外显子双向测序结果发现：基因序列与现有MICA数据库碱基序列不匹配,分析结果显示,与现有等位基因MICA＊002：01序列相比,该样品在外显子3的碱基位置486出现信号“M”,提示该位置出现碱基突变(图2)。

图2 新等位基因MICA＊002:04直接测序结果Fig.2 The nucleotide sequence of newallele MICA＊002:04

表1 MICA-PCR引物、直接及克隆测序引物序列Tab.1 The primer code of MICA PCR,direct sequence and clone sequences

图3 新等位基因MICA＊002:04克隆测序结果Fig.3 The nucleotide sequence of newallele MICA＊002:04

2.2MICA克隆测序结果 为证明直接测序结果,对该样品进行针对MICA外显子3的DNA片段克隆测序,将MICA-PCR产物经纯化回收后,插入克隆于pMD○R20-T Vector载体,重组质粒扩增片段为1 024 bp。经克隆测序分析,再次证实新等位基因在此位置为单个碱基突变,由核苷酸C→A(图3),相应编码子位置20由GCC→GCA,为同义突变。结果与直接测序结果完全一致;证实该序列为全新MICA等位基因(见图4)。

2.3新等位基因确定 该新等位基因序列已被GenBank接受,根据世界卫生组织(WHO)HLA因子命名委员会命名原则的要求,将新等位基因有关材料上报给WHO HLA因子命名委员会(上报编号HWS10011132),该基因于2006年8月获正式命名为MICA ＊ 002 ：04[8]。

3 讨论

MICA基因系统存在免疫遗传多样性,在不同的种族或者同一种族不同群体分布表现出明显的种族特异性。其基因多态性和表达特性与肿瘤密切相关,MICA蛋白表达于多种肿瘤细胞表面,如：胃肠道肿瘤、肺癌、乳腺癌等,对免疫系统中的杀伤作用细胞,如：NK细胞,γ δT细胞,α βCD8+T细胞的主要作用在于作为配体,与免疫细胞表面的激活性受体NKG2D相结合。NKG2D-MIC机制主要表现在免疫细胞表面通过不同的氨基酸碱基形成不同的氢键及疏水键结合,通过诱导契合机制,结合、传递细胞活化信号,激活抗肿瘤免疫细胞的肿瘤杀伤机制[9,10]。

图4 MICA新等位基因MICA＊002:04与MICA＊002:01碱基序列对照图Fig.4 Newallele MICA＊002:04 nucleotide sequence alignments

在MIC-NKG2D抗肿瘤机制中,MICA基因在体内表达形式分为膜型(mMICA)和分泌型(sMICA)两种形式,sMICA降低了肿瘤细胞MICA分子表达强度,而且能诱导 T细胞表面和NK细胞表面受体NKG2D发生内化降解,导致CD8+T细胞和NK细胞NKG2D下调,抑制NK细胞杀伤活性,导致肿瘤逃逸[11-13]。

本文涉及广东汉族人群中MICA基因多态性与恶性疾病相关性研究,逐步探讨MICA作为特定种群中恶性肿瘤遗传诊断标志的可行性,为恶性肿瘤的早期诊断和治疗提供理论依据。MICA基因多态性多表现在碱基突变,DNA序列分析是鉴定MICA新等位基因的主要手段,本文应用直接双向测序法检测MICA等位基因外显子2～5及MICA基因外显子3片段克隆测序两种不同测序路线,对MICA的新等位基因进行碱基序列测定,发现通过两种测序路线所得的序列结果完全一致,因此证实新等位基因MICA＊002：04序列正确可信。新的等位基因MICA＊002：04与 MICA ＊002：01同源 ,区别在于外显子3的位置486核苷酸由C→A,密码子位置20由GCC→GCA,相应编码氨基酸为丙氨酸(Ala)→丙氨酸(Ala),为同义突变。

此MICA新等位基因的发现为人类免疫组织相容性系统(MHC)基因群组添加了具有中国南方人群遗传特异性的新成员,扩大了MICA基因系统的遗传多样性。随着高分辨率的测序技术发展及对MICA系统日益深入的研究,MICA系统有望不断地增添新的成员。此项目的开展有助于建立肿瘤临床诊断免疫遗传标识、确定疾病易感基因,跟踪基因在种群中迁移、演变以及传递路线,对临床免疫遗传学、器官移植、法医学、人类遗传学均有重要的研究意义。

1 Li P,Willies S t,Bauer Set al.Crystal structure of the MHC classⅠhomolog MIC-A,a gamma delta T cell ligand[J].Immunity,1999;10(5)：577-584.

2 孙琳琳,刘利民,孙学科et al.MIC基因的研究进展[J].免疫学杂志 ,2006;22(3) ：131-134.

3 Bahram S,Bresnaha M,Geraghty D Eet al.A second lineage of mammalian major histocompatibility complex class I genes[J].Proc Natl Acad Sci USA,1994;91(14)：6259-6263.

4 Katsuayama Y,Ota M,Ando Het al.Sequencing based typing for genetic polymorphismin exons,2,3,and 4of the MICA gene[J].Tissue Antigens,1999;54(2)：178-184.

5 马 庆,陈 亮,郭晓俊et al.中国南方汉族人群MICA-TM基因座等位基因分布 [J].临床输血与检验,2004;6(4)：241-243.

6 Lo S S,Lee YJ,Wu C Wet al.The increase of MICA gene A9 allele associated with gastric cancer and less schirrous change[J].Br J Cancer,2004;90(9)：1809-1813.

7 Ji L C,Jinn L Y,Fu L Het al.The increase in the frequency of MICA gene A6 allele in oral squamous cell carcinoma[J].J Oral Pathol Med,2002;31(6)：323-328.

8 Marsh S G E,Albert E D,Bodmer W Fet al.Nomenclature for factors of the HLA system[J].Tissue Antigens,2010;75：291-455.

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10 Miller J.The biology of natural killer cells in cancer,infection and pregnancy[J].Experimental Hematology,2001;29：1157-1168.

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12 Dunn G P,K oebel C M,Schreiber R D.Interferons,immunity and cancer immunoediting[J].Nat Rev Immunol,2006;6(11)：836-848.

13 Coudert J D,Zimmer J,T omasello Eet al.Altered NKG2D receptor for tumor immunity[J].Semin Cancer Biol,2006;16(5)：333-343.