CpG ODN佐剂对呼吸道合胞病毒重组疫苗诱导的细胞免疫应答的作用①

李 娜 刘建勋 曾瑞红 (河北医科大学免疫教研室,石家庄050017)

呼吸道合胞病毒(RSV)是婴幼儿下呼吸道感染的最重要病原,主要引起肺炎和支气管炎,严重感染者可导致哮喘综合征;另外,RSV也是老年人和免疫缺陷成人哮喘、肺炎、支气管炎的主要病因,随着老龄社会的来临,因RSV感染而住院和死亡的老年人数逐年上升[1]。接种疫苗是重要的预防措施,世界卫生组织已将RSV疫苗定为优先发展的疫苗之一,但由于免疫病理相关的安全性问题,至今尚无安全有效的疫苗上市。粘附蛋白G是RSV的两种主要跨膜糖蛋白之一,是RSV感染后适应性免疫应答的靶标,M2蛋白是RSV的基质蛋白,含有特异性细胞毒性T细胞(CT L)表位。我们制备了一例RSV重组蛋白疫苗 G1F/M2,含有 G蛋白的中和抗体表位片段(G：125-225)和RSV-M2蛋白的CD8+T细胞表位片段(M2：81-95),并已经对其免疫原性和保护性进行了广泛的研究[2,3]。含非甲基化CpG基序的DNA或寡核苷酸(CpGODN)是目前已知的最有潜力的佐剂,通过激活T oll-like受体9(T LR9)等受体激活细胞,不仅能刺激固有免疫而且还能激活适应性免疫应答[4]。本实验人工合成了硫代CpG2216寡核苷酸(简称CpG),将其作为佐剂与重组疫苗 G1G/M2共免疫BALB/c小鼠,研究其对G1F/M2的细胞免疫原性的佐剂效应。胞;取1×106ml-1SP2/0细胞,加入 G1F/M2蛋白至终浓度为10μmol/L,置CO2培养箱中37℃培养2小时得靶细胞;将效应细胞与靶细胞SP2/0-NS3按效靶比50∶1加载到96孔细胞培养板中,未刺激的SP2/0细胞作为对照细胞,同时设置靶细胞SP2/0自然释放LDH孔和最大释放LDH孔,分别设3个复孔,在CO2培养箱37℃共培养6小时,根据LDH释放试剂盒说明书检测CT L活性。特异性细胞杀伤率(%)=(试验组OD值-自然释放组OD值)/(最大释放OD值-自然释放组OD值)。

1.2.4流式细胞术分析小鼠脾细胞中T细胞的分化情况 无菌取脾,研磨,取100μl 1×107ml-1脾细胞悬液置流式检测管中,一式两份,分别加入10μl标记抗体(FITC-anti-mouseCD4,PE-anti-mouse CD44,Pecy5-anti-mouse CD62L)或(FITC-anti-mouseCD8,PE-anti-mouse CD44,Pecy5-anti-mouse CD62L),混匀 ,4 ℃避光孵育40分钟,加入1.5 ml PBS,混匀,1 200 r/min水平离心5分钟洗涤细胞1次,细胞沉淀用1 000μl PBS悬起,用流式细胞仪分析。

1.2.5ELISPOT法检测分泌IFN-γ和IL-4的细胞每组检测4只小鼠,每只小鼠的脾细胞样品设3个复孔,按试剂盒说明操作：在96孔滤膜板中加100 μl/孔的70%乙醇,室温放置10分钟,倒掉乙醇,用PBS或包被缓冲液洗涤;加100μl/孔适当稀释的捕获抗体,4℃包被过夜;倾空板子,用包被缓冲液洗涤2次,加200μl/孔 RPMI1640完全培养基,室温封闭1小时;弃液 ,加入20μg/100μl/孔用RPMI1640稀释的抗原G1F/M2;每孔加入脾细胞106个/100μl,在37℃5%CO2培养箱中培养36小时;将培养物倒掉,拍干,用PBST洗涤3次,加100μl/孔生物素标记的检测抗体,室温放2小时。弃液,用PBST洗涤4次,加100μl/孔亲和素标记的辣根过氧化物酶,室温放置45分钟,洗涤,加 100μl/孔新配置的 AEC(3-amino-9-ethyl carbazole)底物液,室温显色10～60分钟,观察斑点形成。加200μl/孔蒸馏水洗板3次终止反应。自然干燥,用读板机读板。

1.3统计学分析 用统计软件SPSS10.0分析,组间均数差异应用LSD-t检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

1 材料与方法

1.1试剂和动物 ELISPOT试剂盒为Cayman公司产品;流式细胞仪检测用标记抗体为eBioscience公司产品。碱性磷酸酶标记的IgG购自中山生物技术公司,碱性磷酸酶标记的IgG1和IgG2a二抗为Caltag Laboratories Inc.公司产品;铝盐佐剂alhydrogel为丹麦产品。96孔PVDF滤膜板MAIP S4510为Millipore产品。LDH(乳酸脱氢酶)细胞毒性检测试剂盒购自南京建成生物公司。蛋白纯化柱购自GE公司。硫代CpG2216由 Invitrogen公司合成。6周龄雌性BALB/c小鼠购自河北省实验动物中心。

1.2方法

1.2.1G1F/M2蛋白的制备[5,6]取 PET-G1F/M2质粒转化E.coliBL21菌,37℃培养,用 IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE分析。反复冻融破菌,用6 mol/L尿素溶解包涵体,用Ni+亲和层析纯化;梯度透析复性。

1.2.2小鼠分组及免疫 将雌性BALB/c小鼠随机分为6组,分别为：G1F/M2+CpG(i.n.)、G1F/M2+CpG(i.p.)、G1F/M2+Al(OH)3+CpG(i.p.)、G1F/M2(i.n.)、G1F/M2(i.p.)和正常对照组。每组6只小鼠,2周免疫一次,共免疫3次,最后一次免疫后2周杀小鼠,取脾细胞。用于CT L活性、分泌IFN-γ和 IL-4的细胞、细胞因子检测和CD4+/CD8+记忆细胞的检测。

1.2.3用LDH释放法检测CT L活性 取脾细胞,用20μg G1F/M2蛋白体外刺激脾细胞5天得效应细

2 结果

2.1脾细胞的特异性杀伤活性 各组免疫小鼠的脾细胞在体外与靶细胞共孵育6小时后,用LDH方法检测CT L活性,结果如图1所示。CpG2216作为G1F/M2蛋白的鼻腔免疫佐剂显著增强了其诱导的特异性杀伤效应(图1A)。如图1B显示,CpG2216与G1F/M2混合后经腹腔注射诱导的特异性杀伤活性显著高于单独 G1F/M2腹腔注射诱导的杀伤活性,而且将CpG2216和G1F/M2与常规佐剂Al(OH)3混合后再经腹腔注射免疫诱导了更强的杀伤活性。

2.2ELISPOT检测免疫小鼠脾脏分泌IFN-γ和IL-4的淋巴细胞的水平 各组免疫小鼠脾细胞在体外用抗原 G1F/M2刺激后,ELISPOT检测分泌 IFN-γ和IL-4的淋巴细胞数。如图2A所示：CpG+G1F/M2鼻腔免疫(i.n.)组诱导的分泌 IFN-γ和 IL-4的淋巴细胞数均显著多于 G1F/M2鼻腔免疫(i.n.)组;无论是CpG+G1F/M2(i.n.)还是 G1F/M2(i.n.),所诱导产生的分泌 IFN-γ的淋巴细胞数显著多于分泌IL-4的淋巴细胞数。图2B显示的是腹腔注射免疫的结果：CpG+G1F/M2(i.p.)以及 CpG+Al+G1F/M2(i.p.)诱导了大量的分泌 IFN-γ的淋巴细胞,显著多于 G1F/M2单独免疫组,且CpG+Al+G1F/M2与CpG+G1F/M2组的细胞数之间具有显著差异;对应的各组所产生的分泌IL-4的淋巴细胞数显著少于分泌 IFN-γ的淋巴细胞数,另外,CpG+Al+G1F/M2(i.p.)与CpG+G1F/M2(i.p.)组之间的也有显著差异。已知IFN-γ是典型的Th1型细胞因子,而IL-4则是典型的Th2型细胞因子,从以上结果可见：无论是鼻腔免疫还是腹腔注射免疫,CpG2216单独作为佐剂或与Al(OH)3联合作为佐剂均诱导了Th1型优势应答,有利于宿主抗病毒;另外,从图2A和B可见,在诱导Th1型优势应答方面,两种佐剂联合使用强于CpG2216单独使用,腹腔注射免疫比鼻腔免疫效果好。

图1 G 1F/M2免疫BALB/c小鼠诱导RSV特异性的杀伤效应Fig.1 Induction of specific lysis activity in BALB/c mice following G1F/M2 immunization

图2 被免疫的小鼠体内产生的抗原特异性的分泌IFN-γ和IL-4的细胞数Fig.2 The frequency of antigen-specific IFN-γor IL-4-secreting T cells in splenocytes of mice immunized

2.3脾细胞中的CD4+和CD8+的效应细胞和记忆细胞的百分率 已知CD44+CD62L-的细胞为效应细胞,CD44+CD62L+的细胞为记忆细胞。取小鼠的脾细胞,用流式细胞仪分别检测CD4+或CD8+的脾细胞中的CD44+CD62L-和CD44+CD62L+的细胞。如表1所示为 CD4+/CD8+的脾细胞中 CD44和CD62L的表达情况,在CD4+的脾细胞中,CpG+G1F/M2(i.n.)和 G1F/M2(i.n.)组的结果相似,均产生了大量的 CD44+细胞(效应细胞),而几乎没有CD44+CD62L+双阳性的细胞;CpG+G1F/M2(i.p.)和CpG+Al+G1F/M2(i.p.)即诱导产生了CD44+单阳性细胞,也产生了CD44+CD62L+双阳性的细胞(分别为24.9%和16.1%),即记忆细胞。CD8+的脾细胞中CD44和CD62L的表达情况与上述结果类似,CpG+G1F/M2鼻腔免疫组仅产生CD44+单阳性细胞 ,而 CpG+G1F/M2(i.p.)和 CpG+Al+G1F/M2(i.p.)即诱导产生了CD44+单阳性细胞,也产生了CD44+CD62L+双阳性的细胞(分别为 13.9%和9.9%)。这些结果表明：CpG2216作为鼻腔免疫佐剂未能诱导显著的免疫记忆,而作为腹腔免疫佐剂则刺激产生了大量的记忆细胞,CpG2216与Al(OH)3联合使用在诱导记忆应答方面没有优势。

表1 脾细胞中CD4+/CD8+的效应细胞和记忆细胞百分率Tab.1 Percentage of CD4+/CD8+effector cells or memory cells in spleen cells

3 讨论

重组蛋白疫苗对于免疫细胞来说是一种外源性抗原,容易激活体液免疫和经MHCⅡ类途径激活CD4+Th2细胞应答,不利于诱导细胞毒性T淋巴细胞特异性杀伤活性以及Th1型免疫应答,而机体对病毒感染的防御主要通过激活细胞免疫应答、通过对病毒感染的细胞特异性杀伤来清除病毒。佐剂是指能够增强和/或调节抗原的免疫应答的一类物质。近年来,随着固有免疫细胞的T LR等模式识别受体及其配体病原相关分子模式研究的深入,佐剂科学取得了快速发展;CpG是T LR9的配体,二者结合后以MyD88依赖的方式激活NF-κB等转录因子,上调细胞因子和趋化因子的表达,促进Th0向Th1分化;目前发现有3中结构不同的CpGODN,分别为A、B、C型。A型ODN含有一个以CG为中心的回文结构5′Pu-Py-CG-Pu-Py3′,3′端具有 polyG 尾巴;CpG2216为A型ODN,研究表明能刺激单核细胞分泌促炎症细胞因子、Th1型细胞因子以及淋巴细胞毒性作用[4,7,8]。本研究结果表明：CpG2216作为RSV重组疫苗 G1F/M2的佐剂,无论是鼻腔还是腹腔注射免疫均诱导了显著的特异性杀伤活性和Th1型免疫应答;与以前的研究结果一致。另外,流式细胞检测技术的结果表明：CpG2216与 G1F/M2混合免疫可显著增强记忆性免疫应答。Al(OH)3即铝盐佐剂,是常用的人用佐剂,能够吸附大量的蛋白质,具有储库作用,近几年的研究表明铝盐佐剂也具有刺激单核细胞等免疫作用,本研究结果显示CpG2216与Al(OH)3联合使用能激活更多的分泌IFN-γ和 IL-4的淋巴细胞,且分泌 IFN-γ的淋巴细胞数显著多于分泌IL-4的淋巴细胞数,提示诱导了Th1型应答,这是一种有利于清除病毒的细胞免疫应答。总之,CpG2216作为RSV重组疫苗 G1F/M2的佐剂,可显著增强细胞免疫应答,是一种理想的佐剂。

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