AN221 HPLC-UV、Acclaim混合基质柱WCX-1快速检测液体奶和奶粉中的三聚氰胺

2011-01-16

环境化学 2011年12期

戴安(DIONEX)仪器分析园地

三聚氰胺是一种用于塑料和化学肥料生产的化学原料.最近出现了一些婴儿食品(奶粉)被三聚氰胺污染的现象.不法分子通过掺加三聚氰胺来提高奶粉中蛋白质测定量，三聚氰胺也被掺到动物饲料中以提高蛋白质测定量.

三聚氰胺的定量检测方法有酶免疫测定法(EIA)、GC-MS、LC-MS、HPLC-UV等.中国政府颁布的检测原奶和奶制品中三聚氰胺检测方法包括了HPLC-UV、LC-MS和GC-MS，但是GC/LC-MS的正常运行需要很高的成本，并且GC-MS样品衍生化需要较高的劳动强度，这样就限制了该标准在奶制品企业中的推广应用，因此HPLC-UV方法仍是目前在奶制品企业中普及的检测方法.针对大批量需要检测的原奶，推荐另一种HPLC-UV方法快速检测原奶，但是该方法在奶制品的检测中具有局限性.

本文介绍一种简单的HPLC方法，同时快速检测液体奶和奶粉中三聚氰胺.该方法使用Acclaim混合基质WCX-1色谱柱、UltiMate® 3000 HPLC-UV高效液相色谱、醋酸盐缓冲液和乙腈为流动相进行检测.单个样品10 min内完成分析.Acclaim混合基质WCX-1色谱柱使用硅胶基质，其分离原理含有疏水和弱离子交换特点，对离子化和中性的化合物表现出了很好的分离特性.使用UltiMate® 3000 HPLC-UV高效液相色谱和Acclaim混合基质WCX-1色谱柱能同时快速分析液体奶和奶粉中的三聚氰胺.

1 实验方法

1.1 仪器与试剂

仪器:Dionex UltiMate 3000 HPLC系统包括有HPG 3400A泵，WPS 3000TSL自动进样器，TCC-3000柱温箱，VWD-3400RSUV-Vis检测器.Dionex SummitUVD-340U PDA，Chromeleon® 6.80 SP5工作站.Kudos® SK3200LH 超声波发生器(KudosUltrasonic Instrumental Co.，Shanghai，China)，梅特勒 Toledo AL-204 电子天平(梅特勒(上海)公司，上海)，Anke®TGL-16B离心机(Anting科学仪器公司，上海)，IKA® MS1微型振荡器(广州)

试剂与标准品:水，Milli-Q® Gradient A 10;甲醇(CH3OH)，HPLC级，Fisher;乙腈(CH3CN)，HPLC级，Fisher;醋酸铵(NH4Ac)，分析纯，SCRC，China;醋酸(HAc)，分析纯，SCRC，China;辛烷磺酸钠 (98%)，色谱纯，USA;三聚氰胺(99.0%)，HPLC 级，Fluka.

色谱条件:保护柱:Acclaim混合基质WCX 1，5μm，4.3 mm ×10 mm，P/N 068354，预柱，P/N 59526;分析柱:Acclaim混合基质WCX-1，5μm，4.6 mm ×250 mm，P/N 068352;柱温:30℃;流动相:醋酸盐缓冲系统 (700 mL，10 mmol·L－1HAc 和 300 mL，10 mmol·L－1NH4Ac 混合，pH 4.3)-CH3CN(8∶2，V/V);流速:1.0 mL·min－1;进样体积:20μL;紫外检测器:吸收波长240 nm.

1.2 标准品溶液的制备

标准品储备液:精密称定100 mg的三聚氰胺，用50%甲醇水溶液定容在100 mL容量瓶中，得到三聚氰胺浓度为1000 μg·mL－1.

标准溶液:制备7份标样用来校准，每个标样加入一定量的标准品储备液，醋酸水溶液流动相稀释，三聚氰胺的浓度分别是 0.05、0.1、0.2、1.0、5.0、20 和 40 μg·m L－1.

奶粉样品:加入1 g左右精确称重的干燥奶粉样品至15 mL离心管，添加10 mL水，涡流振荡1 min后，超声波超声30 min.取出，滴加1 mL乙酸溶液(3%，V/V)，4℃下放置至少30 min后，离心15 min(10000 r·min－1)，移取上清液至10 mL容量瓶中，水定容至刻度，进样前，0.2μm微孔滤膜过滤.

液体奶样品:精确量取10 mL液体奶样品至15 mL体积离心管后，直接加入1 mL的的乙酸(3%，V/V)洗脱液，4℃下静置30 min.余下操作步骤同奶粉样品处理.

奶粉和液体奶加标回收:加入40μL三聚氰胺标准品储备液至15 mL离心管中，分别加入已精确称定1 g左右的干燥奶粉和精确量取10 mL左右的液体奶，余下步骤同奶粉和液体奶的操作.

2 结果与讨论

2.1 优化牛奶和奶粉样品的制备过程

一般处理牛奶和奶粉样品分两个步骤，样品提取和SPE小柱净化，50℃ N2吹干.离子交换分析法(IEX)的处理方法比此更简便，但是只适用于液体奶检测.因此开发一种高效而更简便并同时处理牛奶和奶粉的方法十分必要.我们开发的方法不需要过SPE小柱和样品干燥，只需加入乙酸洗脱液，离心，过滤，该方法同时适用于液体奶和奶粉检测，也适用反相离子对色谱方法(RP-PIC)分析.图1表明，三聚氰胺检测波长240 nm，该样品制备方法无论使用Acclaim混合基质WCX-1色谱柱或者RP-PIC方法的Acclaim 120 C18色谱柱，都能得到很好的三聚氰胺图谱，目标峰无杂质峰干扰.

图1 牛奶样品和牛奶样品加标图谱(A.Acclaim混合基质WCX-1色谱图;B.Acclaim 120 C18色谱图)

2.2 优化色谱条件

三聚氰胺是亲水性成分，在经典RP反相色谱柱(例如C18或C8)中保留较弱，大多数反相柱使用离子对试剂，流动相中添加离子对试剂，例如辛烷磺酸盐，三聚氰胺就能很好地保留.然而，离子对试剂可能会污染固定相，会改变反相柱的保留性能，如果这根色谱柱换成其它分离方法时，可能就得不到原色谱峰.RP-PIC方法通常不适合同MS检测器连接，因此尝试在Acclaim混合基质WCX-1色谱柱上分离离子化的三聚氰胺，醋酸缓冲盐洗脱.

Acclaim混合基质WCX-1色谱柱特性是混合硅胶基质填料，同时具有疏水性和弱离子交换特性，流动相pH值能影响到固定相的电荷数和疏水性，当流动相pH值低于固定相羧酸根的p Ka值时，离子交换作用失活，因此疏水作用成为保留机制的主要作用.当流动相pH高于固定相p Ka值时，离子交换作用激活，因此两种分离机制都对被分析物的保留有影响，保留时间取决于分析物特性.大量实验结果发现，流动相缓冲盐pH值低于3.5或大于5.0时，三聚氰胺都没有被很好地保留.离子交换作用是能改变带电荷化合物在色谱柱中保留的关键因素，在碱性环境中流动相离子浓度增加后，三聚氰胺保留时间降低;疏水性保留特性明显受有机相比例影响，增加有机相比例后，其它的条件(例如离子作用力、pH、温度等)保持不变，所有种类的分子(酸、碱和中性化合物)保留时间都会提前.

针对液体奶和奶粉样品，流动相为10 mmol·L－1醋酸铵，pH=4.3，20%MeCN.对于更复杂的样品，应当使用更强缓冲能力的缓冲盐溶液，同时三聚氰胺的保留时间提前，而减少流动相中乙腈的比例不大可能恢复原来的保留时间位置.

2.3 色谱性能

图2为三聚氰胺标准品溶液5次连续进样色谱图，每次进样20μg·mL－1，保留时间和峰面积重复性良好.三聚氰胺标准曲线由7个不同浓度的标准品溶液制得，每个标准液重复进样5次.标准曲线和样品定量使用外标法，如图3，线性范围0.05—40 μg·mL－1，线性方程为:A=0.9120C，相关系数0.9999，曲线通过原点.

图2 5次20μg·mL－1三聚氰胺标准溶液连续进样重叠图

图3 三聚氰胺标准曲线

重复性方法学考察通过10次连续进样1μg·mL－1标准品溶液.保留时间RSD为0.037，峰面积的RSD为0.472.三聚氰胺检测限MDL计算公式:式中，S=重复分析标准差，n=重复次数，t(n－1，1－α=0.99)=置信度99%、自由度 n－1的Student's t值.1 μg·mL－1标准品溶液重复进样10 次计算的检测限 MDL 为0.015 μg·mL－1.

2.4 样品分析

取5份样品，包括3份奶粉(1#—3#)和2份液体奶(4#和5#)，用新前处理方法和WCX色谱法进行分析，结果发现，1#样品中没有检测到三聚氰胺，而其它5份样品都检测到了三聚氰胺.图4显示了所有色谱图.另在1#和4#样品处理前加标样三聚氰胺，结果两个样品出现了明显的三聚氰胺色谱峰.

图4 色谱图 (A.奶粉1#— 3#;B.液体奶4#和5#)

2.5 样品制备和分析方法的对比

取3份奶粉样品，1#—3#，和另外3份奶粉样品6#—8#，分别使用我们的新方法和活化SPE小柱的奶粉检测方法(GB/T 22388 2008)，制备后的样品分别用Acclaim 120 C18色谱柱、GB/T 22388 2008色谱条件分析方法A和Acclaim混合基质WCX-1色谱柱、以上述色谱条件分析分析方法B，结果见表1.全部样品结果包括两种样品制备过程和两种色谱方法的分析，数据对比表明，全部6份样品使用这两种样品制备方法或色谱分离方法后，结果一致性良好.

表1 牛奶样品检测结果对比(mg·kg－1)

对于复杂基质的奶制品可能有三聚氰胺假阳性，与三聚氰胺标准品溶液对比紫外光谱图是有效的办法.分析样品8#时，分别使用GB/T 22388 2008中的样品制备方法和混合基质WCX-1色谱柱方法，发现一个和三聚氰胺保留时间接近的小峰，将此峰标记为三聚氰胺时浓度为3.3 mg·kg－1.使用其它样品处理方法和色谱方法没有在该样品中检测到三聚氰胺.在VWD紫外检测器后连接一个PDA阵列检测器，对比紫外光谱图，如图5中所示，结果显示该色谱峰不是三聚氰胺，使用PDA阵列检测器分析有助于减少三聚氰胺假阳性误判.