黄芪注射液中黄芪甲苷含量测定HPLC法的比较研究

李 燕

（十堰职业技术学院生化与环境工程系，湖北十堰442000）

在我国常见药物中，具有营养和抗氧化等药理活性和药用价值的，多为对羟基苯甲酸和对羟基肉桂酸的衍生物，这类药物与人体健康密切相关［1］［2］。黄芪中含有的黄芪皂苷、黄酮等化合物具有较强的生物活性［3］［4］，黄芪注射液可用于治疗细胞免疫功能低下的慢性肝炎和慢性活动性肝炎，效果良好，也可用于治疗白细胞减少症及血小板减少性紫癜。对蒙古黄芪中的皂苷类和黄酮类有效成分的分析研究表明，皂苷类成分共14个共有峰，黄酮类成分共有12个共有峰，显示其化学成分复杂，对于有效物质的提取检测要求高［5］［6］。

1 材料与仪器

试剂：95% 乙醇；无水乙醇；氯仿；正丁醇；丙酮；无水乙醚；盐酸；碳酸钡；乙酸酐。以上试剂均为分析纯。仪器：UV－2401P紫外分光光度仪（岛津公司），TG328B光电分析天平（岛津公司）；CKQ－250DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。Gilentlloo高效液相色谱仪（岛津公司）；HH－S2系列恒温水浴锅（岛津公司）；FTIR－8400S型红外光谱仪（岛津公司）；GSP－84－02型磁力恒温搅拌器（岛津公司）。黄芪注射液（万通药业公司，批准文号：国药准字Z23020820／Z23020822）。

2 方法与结果

2.1 黄芪甲苷的提取

黄芪注射液50ml加入6倍体积量（V／V）的60%乙醇，NaOH饱和溶液调节pH至12，温度：60℃，加热回流提取2次，得到提取液200ml，然后进行减压浓缩得到浓缩液约100ml。然后重复浓缩液萃取得到黄芪甲苷粗品约25.0mg，经HPLC检测纯度超过80%。再进行反相硅胶C－18常压色谱柱分离，60%甲醇洗脱，得到黄芪甲苷纯品约13.5mg，HPLC检测纯度符合药典标准。具体HPLC图与主峰含量见图1与表1。同时扫描结果显示，黄芪甲苷在325nm波长处吸收最强，灵敏度较高。以峰面积积分值为纵坐标，对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线。得回归方程：黄芪甲苷Y＝13.614X－1.4897，r＝0.9999。线性范围为10.2－102μg／mL。

图1 黄芪甲苷纯品HPLC色谱图

表1 重复性试验结果

2.2 样品的准备

将3份不同生产日期生产的黄芪注射液抽提后放置20mL容量瓶中，用提取液约15mL浸泡，室温下放置4小时，然后超声提取30分钟，过滤后滤液于物理蒸干溶剂，残渣用6mL甲醇－甲酸溶解，然后定容于5mL容量瓶中，4℃下保存待测。

2.3 精密度和准确度

取混合对照品溶液20mL，进行HPLC检测，连续进样6次，测得黄芪甲苷面积的相对标准偏差分别为0.59%，显示其精密度良好。然后精密称取已知含量的3份黄芪甲苷样品，按样品准备与处理方法制备计算回收率，结果分别为95.9%、94.5%和95.0%，显示其回收率高。具体情况见表2。

表2 黄芪甲苷样品黄芪甲苷的回收率（n＝3）

2.4 稳定性试验

3份样品按照制备方法制备溶液后，分别于0小时，1d，2d，3d时进样测定，测定结果的峰面积的相对标准稳定性偏差见表3，结果表明3份样品溶液在3d内基本都能保持稳定。

表3 黄芪甲苷样品黄芪甲苷的稳定性（n＝3）

2.5 含量测定

分别精密吸取3份黄芪甲苷样品的提取液20 mL，进样，测定样品中黄芪甲苷的含量，结果见表4。

表4 黄芪甲苷样品黄芪甲苷的含量（n＝3）

3 讨论

当前黄芪甲苷的测定方法有薄层色谱法（TLC）、毛细管电泳法（CZE）等［7］［8］，但这些测定方法都普遍存在灵敏度不高、重复性不强的现象［9］［10］。本试验建立了测定黄芪注射液中黄芪甲苷的HPLC法，采用反相硅胶C－18常压色谱柱分离，60%甲醇洗脱，在选择检测波长时，以流动相为溶剂稀释对照品，采用紫外分光光度法在200－400扫描吸收光谱，结果表明黄芪甲苷在325nm处有最大吸收，灵敏度较高，故选定325nm为检测波长。最佳提取条件为：乙醇用量6倍于注射液体积，提取温度为60℃，pH值为12。同时HPLC法操作简便迅速，精密度和准确度均较理想，稳定性强，回收含量高，可为测定黄芪注射液中黄芪甲苷物质提供方法依据。

［1］竺心影.药理学［M］.北京：人民卫生出版社，2008：326，328.

［2］Beconi Barker MG.Dertrmination of ceftiofur and its desfumylceffiofur related metabolites in swine tissues by highperformance liduid chromarography［J］.J chromatography BlomedAppl，2008（2）：231－244.

［3］杨桂芳，王 鹏，中药指纹图谱的建立方法和作用［J］.时珍国医国药，2004（1）：58－60.

［4］屠鹏飞.中药材指纹图谱的建立及技术要求实例解说［J］.中国药品标准，2010（1）：22－29.

［5］杨维平，张琰图，章竹君.高效液相色谱化学发光法研究异烟阱和利福平［J］.化学学报，2003（2）：303.

［6］魏 月，章竹君，孙永华，等.高效液相色谱化学发光法测定淫羊霍甙［J］.陕西师范大学学报，2006（3）：63.

［7］马艳蓉，刘 泓，柴国林，张莅峡.HPLC－ELSD测定黄芪中黄芪甲苷含量及相关试验条件选择的探讨［J］.现代中药研究与实践，2003（6）：17－19.

［8］杨 进，冯念伦.高效液相色谱原理、临床应用及常见故障处理［J］.医疗设备信息，2001（1）：18－19.

［9］龚盛昭，杨卓如，曾海宇.微波提取黄芪皂苷的工艺研究［J］.中成药，2005（8）：889.

［10］王忠壮，胡晋红.现代中药学［M］.上海：第二军医大学出版社，2006：352.