葛根黄酮的提取工艺及三波长—分光光度法测定其含量

任雪琴，陈 新，吴 兵，任晓慧

(武汉工业学院生物与制药工程学院，湖北武汉430023)

葛根黄酮的提取工艺及三波长—分光光度法测定其含量

任雪琴，陈 新，吴 兵，任晓慧

(武汉工业学院生物与制药工程学院，湖北武汉430023)

采用乙醇回流提取法，考察乙醇浓度、提取时间、料液比、提取次数4个单因素对葛根黄酮提取率的影响，并采用L9(34)正交试验确定葛根黄酮的最佳提取工艺条件。文章以芦丁为标准品，采用三波长—分光光度法测定葛根黄酮的含量可以消除吸收峰不对称等影响。实验结果：回归方程为 ΔA=0.0117+0.0126c，相关系数 r=0.9996，芦丁的浓度在 0—30 μg·mL－1范围内，分别在波长λ1=495 nm，λ2=412 nm，λ3=368 nm处测吸光度时，ΔA与浓度c之间呈良好的线性关系。影响葛根黄酮提取率的各因素主次顺序为：乙醇浓度＞提取时间＞料液比＞提取次数。最佳提取工艺参数为：葛根原料过80目药典筛、提取温度70℃为前提条件，乙醇浓度为70%，料液比为1∶20，提取2次，每次2.5 h，在此条件下葛根黄酮提取率为 0.1452 mg/g。

葛根;黄酮;提取工艺;三波长—分光光度法

葛根为豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.)Ohwi或甘葛藤Pueraria thomsonii Benth.的干燥根，为临床常用中药，史载于《神农本草经》，味甘、辛、性平，具有解肌退热、生津、透疹、升阳止泻等功效。目前，葛根主要用于外感发热头痛、项背强痛、口渴、消渴、麻疹不透、热痢、泄泻等症状［1］。葛根的化学成分主要有黄酮类、香豆素类、三萜类、多糖类等化合物。葛根黄酮目前主要用于治疗心脑血管类疾病，如高血压、高血脂、偏头痛、冠心病、心肌梗塞、心绞痛、视网膜动脉阻塞、视网膜静脉阻塞、突发性耳聋等症［2］，同时广泛用于保健食品(用于解酒、丰胸、延缓女性更年期、糖尿病引起的并发症等)等领域［3］。

测定黄酮类化合物通常采用高效液相色谱法(HPLC)、荧光光度法、分光光度法等。一般常用的分光光度法存在一定缺陷，如果加入铝盐使黄酮类化合物与铝离子形成稳定的配合物，吸收带Ⅰ明显红移的同时吸光度也增加，但干扰成分会使吸收峰不对称［4］。本文在测定标准曲线、单因素和正交试验的结果时加入铝盐，并采用三波长—分光光度法测定葛根黄酮的含量，这样可以有效消除吸收峰不对称给定量分析造成的影响，并校正了基于干扰组分的吸收光谱具有线性吸收产生的基线倾斜，芦丁的浓度在0—30 μg·mL－1范围内线性相关良好。

1 实验部分

加入铝盐会使黄酮类化合物与铝离子形成稳定的配合物，其反应过程如图1所示。黄酮类化合物的紫外光谱吸收中，主要吸收带是由300—400 nm之间的吸收带Ⅰ和240—280 nm之间的吸收带Ⅱ组成［5］。葛根中含有的香豆素、甾体皂苷、脂肪酸、三萜类化合物等均有一定程度的紫外吸收，会干扰黄酮的测定。加入铝盐后，吸收带Ⅰ明显红移，吸光度也增加。本试验选择三氯化铝作为铝离子稳定剂。另外，干扰成分使吸收峰不对称，本试验采用三波长—分光光度法来测定葛根黄酮的含量。三波长—分光光度法的基本原理［4］如图2所示。

图1 黄酮类化合物与铝盐反应原理

图2 三波长—光谱法的基本原理

在吸收光谱曲线上，用作图法适当地选择三个波长 λ1，λ2，λ3，测定其吸光度 A1，A2，A3。由图2 可知式

式中：ε为待测组分在各波长处的摩尔吸光系数;b为光程;c为待测组分的摩尔浓度。

1.1 实验仪器与材料

UV－5800PC型紫外/可见分光光度计(上海元析仪器有限公司);旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司);SHZ－D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市英裕予华仪器厂);FW100型万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司);HH－6数显恒温水浴锅(国华电器有限公司);SB－5200D双频超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司);SZ－93自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)。

干燥野葛根(购自武汉市神草中药饮片有限责任公司，湖北恩施产)，粉碎，过80目药典筛。

芦丁标准品(中国药品生物制品鉴定所，供含量测定用，批号0080－9705);70%乙醇，无水乙醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司);AlCl3·6H2O(结晶，分析纯，天津市天达净化材料精细化工厂);水为双蒸水。

1.2 实验方法

1.2.1 标准曲线的绘制

精确称取1.8095 g AlCl3·6H2O结晶，用双蒸水溶解并定容至100 mL容量瓶中，配置成1%三氯化铝溶液待用。

精确称取干燥至恒重的芦丁标准品4.6 mg，用无水乙醇溶解并定容至25 mL。准确吸取0.25 mL，0.50 mL，0.75 mL，1.0 mL，1.25 mL 和 1.5 mL 分别注入10 mL容量瓶中，用无水乙醇补足到2.5 mL(如吸取0.25 mL的则需加2.25 mL无水乙醇补足，依次类推)，同时另取1个10 mL容量瓶加入无水乙醇2.5 mL作为参比溶液，加1%三氯化铝溶液，充分混合至刻度，用1 cm的石英比色皿在波长190—700 nm范围内扫描，绘制出其吸收曲线，见图3。用作图法确定出三个测定波长，分别为 λ1=495 nm，λ2=412 nm，λ3=368 nm。在测定波长处，分别测定出用1%三氯化铝溶液定容过的芦丁标准品溶液的吸光值，给出ΔA，并计算出相应的浓度值。

图3 不同浓度芦丁的紫外吸收光谱图

1.2.2 乙醇回流提取单因素实验方法

根据预实验确定影响葛根黄酮提取率的主要因素为乙醇浓度、提取次数、料液比、提取时间，然后进行单因素实验：(1)考察乙醇浓度对黄酮提取率的影响，试验设计乙醇浓度50%、70%、90%三个水平;(2)考察提取时间对黄酮提取率的影响，试验设计1 h、2 h、3 h三个水平;(3)考察料液比对黄酮提取率的影响，试验设计 1∶10、1∶20、1∶30 三个水平;(4)考察提取次数对黄酮提取率的影响，试验设计1次、2次、3次三个水平。

1.2.3 正交实验设计

在单因素试验基础上，以提取率最高值的条件为中心点，取乙醇浓度、提取次数、料液比、提取时间四个因素，按照正交表用L9(34)安排试验［6］。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

根据1.2.1的方法测定吸光值并求得ΔA值，绘制标准曲线见图4。ΔA值与浓度关系的回归方程为：ΔA=0.0117+0.0126c，线性相关系数 r=0.9996，说明芦丁的浓度在 0—30 μg·mL－1范围内，分别在 λ1=495 nm，λ2=412 nm，λ3=368 nm 处测吸吸光度值时，ΔA与浓度c之间呈良好的线性关系，可按照标准曲线进行定量分析。

图4 芦丁的标准曲线

2.2 稳定性实验

用与绘制标准曲线相同的方法配制的样品进行稳定性实验。在三个测定波长 λ1=495 nm，λ2=412 nm，λ3=368 nm处分别测定其吸光度值，并根据公式(1)计算出ΔA。结果见表1。

表1 稳定性实验

结果表明：样品放置6 h以上，其ΔA值只在小数点后第三位上变化，由于人为因素及系统误差的存在，因此认为样品的稳定性良好，ΔA值随时间几乎不变。

2.3 单因素试验结果分析

2.3.1 不同乙醇浓度对葛根黄酮提取率的影响

将回流提取的温度设定为70℃，料液比为1∶20，提取次数为2次，每次提取2 h，乙醇浓度分别为50%、70%、90%，结果见图5。试验结果表明，其他条件不变的情况下，乙醇浓度为70%时，葛根黄酮的提取率达到最高。

图5 不同乙醇浓度对葛根黄酮提取率的影响

2.3.2 提取时间对葛根黄酮提取率的影响

将回流提取的温度设定为70℃，乙醇浓度为70%，料液比为1∶20，回流提取2次，每次分别提取1 h、2 h、3 h，考察提取时间对黄酮提取率的影响，结果见图6。试验结果表明，随着提取时间的推移，黄酮含量逐渐增高，但是2 h和3 h时测得的含量增幅不大，考虑到对生产周期的影响，为了缩短生产周期，最佳提取时间选择为2 h。

图6 不同提取时间对葛根黄酮提取率的影响

2.3.3 料液比对葛根黄酮提取率的影响

将回流提取的温度设定为70℃，乙醇浓度为70%，回流提取2次，每次2 h，在此基础上取料液比为1∶10、1∶20、1∶30 进行单因素试验，考察不同料液比对葛根黄酮提取率的影响，结果见图7。试验结果表明，料液比为1∶30时葛根黄酮的提取率达到最高，但考虑到工业生产节约成本，并且1∶20时乙醇已完全浸没葛根样品，能够保证提取完全，因此选择1∶20为最佳料液比。

图7 不同料液比对葛根黄酮提取率的影响

2.3.4 提取次数对葛根黄酮提取率的影响

将回流提取的温度设定为70℃，乙醇浓度为70%，料液比为1∶20，每次提取时间为2 h，考察不同提取次数对葛根黄酮提取率的影响，结果见图8。试验结果表明，随着提取次数的增加，葛根黄酮的提取率逐渐趋于平稳，提取2次后提取率增加不再明显，所以选择2次回流提取。

图8 不同提取次数对葛根黄酮提取率的影响

2.4 正交试验结果分析

在单因素试验基础上选定乙醇浓度、提取时间、料液比、提取次数四个因素，每个因素选三个水平，以葛根黄酮提取率为考察指标，按照正交表L9(34)安排试验，各因素水平见表2，正交试验结果见表3。

表2 正交实验因素水平表

表3 正交试验直观分析表

正交试验结果直观分析表明，因素主次顺序为，A＞B＞D＞C，即乙醇浓度＞提取时间＞液料比＞提取次数;最优提取方案为A2B3C2D2，即乙醇浓度为70%、提取时间为2.5 h、提取次数为2次，料液比为1∶20，由于此方案不在正交设计的9个实验当中，所以需要以此条件做验证试验，验证试验结果得到葛根黄酮的提取率为0.1452 mg/g，验证试验结果均大于正交试验的提取率，所以验证试验的条件可以作为葛根黄酮的最佳提取条件。

3 结论

由于吸光值ΔA值与黄酮的质量浓度成正比，在所选择的3个波长处，其相应的吸收光谱曲线上三点在一条直线上，有效地消除本底漂移及吸收峰不对称给定量分析造成的影响，因此三波长—分光光度计法为测定葛根中总黄酮含量提供了更准确可行的方法。本实验结果表明影响葛根黄酮提取率的各因素主次顺序为：乙醇浓度＞提取时间＞料液比＞提取次数。最佳提取工艺参数为：葛根原料过80目药典筛、提取温度70℃为前提条件，乙醇浓度为70%，料液比为1∶20，提取 2 次，每次 2.5 h，在此条件下葛根黄酮提取率为0.1452 mg/g。

［1］ 国家药典委员会.中国药典(Ⅰ部)［M］.北京：化学工业出版社，2005：233.

［2］ 郭宇洁，孟硕.葛根素和葛根黄酮的药代动力学研究概述［J］.中国实验方剂学杂志，2009，15(6)：82.

［3］ 唐春红.国内外葛根营养保健功能的研究与开发现状［C］//中国食品添加剂生产应用工业协会.2002年营养强化及特种营养食品等专业委员会年会论文.中国成都：中国食品添加剂生产应用工业协会，2002：84－89.

［4］ 回瑞华，侯冬岩，关崇新，等.三波长－光谱法测定沙棘果汁中黄酮的含量［J］.光谱学与光谱分析［J］.2005，25(2)：266 －269.

［5］ 肖坤福.三波长分光光度法测定多穗柯叶中黄酮的含量［J］.时珍国医医药，2006，17(6)：980－981.

［6］ 李云雁，胡传荣.试验设计与数据处理［M］.北京：化学工业出版社，2005.

Study on extracting technology of flavonoids from Pueraria Lobata Ohwi and determination of flavonoids by three－wavelength spectrophotometry

REN Xue－qin，CHEN Xin，WU Bing，REN Xiao－hui
(School of Biology and Pharmacuetical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China)

To optimize the ethanol reflux extraction of flavonoids from Pueraria lobata Ohwi，ethanol concentration，extraction time，material－solvent ratio and extraction times were used as the criteria in the progressive single factor experiment，and an orthogonal test of L9(34)was designed.Taking rutin as the standard，determination of Pueraria lobata Ohwi flavonoids measured by adopting three－wavelength spectrophotometry can eliminate the absorbance error.The regression equation of concentration ΔA was obtained and listed as follows：ΔA=0.0117+0.0126c with a relation coefficient r=0.9996.The experimental results demonstrating the rutin concentrations in 0 －30 μg·mL－1was measured at wavelength λ1=495 nm，λ2=412 nm，λ3=368 nm.The influence factors’priority was：the ethanol concentration＞extraction time＞material－solvent ratio＞extraction times.For the primise condition of puerarin material for a 80 mesh pharmacopoeia sieve and temperature of 70℃，the optimum ethanol extraction process was as follows：ethanol concentration of 70%，material－solvent ratio of 1∶20，extraction times of 2 and each time of 2.5 hours.In this condition，the Pueraria lobata Ohwi flavonoids extraction rate was 0.1452 mg/g.

Pueraria lobata Ohwi;flavonoids;extraction technology;three－ wavelength spectrophotometry

O 657.32

A

1009-4881(2011)04-0032-05

10.3969/j.issn.1009-4881.2011.04.009

2011-07-20.

任雪琴(1985－)，女，硕士研究生，E －mail：rxq1009@126.com.

陈新(1978 －)，男，副教授，E －mail：chenxin_0001@126.com.

国家自然科学基金项目(81001625);教育部科学技术研究重点项目(210138).