黑曲霉原生质体诱变选育果胶酶高产菌株
2011-01-12陈林王明兹柯崇榕高媛媛庄秀红杨章萍牛俊巍黄建忠
陈林,王明兹,柯崇榕,高媛媛,庄秀红,杨章萍,牛俊巍,黄建忠
(福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心生命科学学院福建省现代发酵技术工程研究中心,福建福州350108)
果胶是一种广泛存在于植物界中的高分子聚糖化合物,是植物细胞壁的重要组成成分[1]。果胶酶是能分解果胶类物质的复合酶,通常包括原果胶酶(Protopectinase)、果胶酯酶(Pectinesterase)和果胶解聚酶(Depolymerizing enzymes)[2]。果胶酶是人们生活中最早应用的酶类之一,也是当前世界四大酶制剂之一[3],广泛应用于果蔬汁的生产和澄清[4]、天然产物提取、纺织品生物脱胶[5]、造纸生物制浆、食品加工以及单细胞产品生产等[6]。果胶酶的工业化生产均采用微生物发酵方法进行,选育果胶酶高产菌株是国内外果胶酶研究热点。Nakkeeran等[7]筛选到1株碳黑曲霉As-pergillus carbonarius,通过深层固体发酵聚半乳糖醛酸酶酶活力高达7 000 U/mg;杜国军等[8]通过紫外诱变选育了1株果胶酶活力为2 000 U/g的黑曲霉HY。黑曲霉(A.niger)是国际公认的安全菌株(GRAS),也是美国(FDA)认可使用安全的产酶微生物之一。黑曲霉产生的果胶酶酶系最全,可直接用于食品工业。黑曲霉EIM6是杨欣伟等[9]筛选获得的1株果胶酶高产菌株,其果胶酶活力可达46 598.08 U/mL。本文采用UV和NTG原生质体诱变技术,筛选高产果胶酶的黑曲霉突变株,为发酵生产果胶酶提供稳定的生产菌株,具有一定的理论和应用价值。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株黑曲霉(Aspergillus niger)EIM6,由福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心保藏。1.1.2培养基孢子产生与菌丝生长培养基:PDA培养基[10];原生质体再生培养基:PDA固体培养基(添加NaCl 0.5 mol/L);发酵产酶培养基(%):甜菜渣2.8,橘皮粉4.0,KH2PO40.8,(NH4)2SO40.4,CaCO30.6,自然pH;筛选平板(%):果胶0.2,琼脂2.0。
1.2 方法
1.2.1 果胶酶活力测定采用3,5-二硝基水杨酸法(DNS法)[9]测定果胶酶活力。1个酶活力单位定义为在50℃,pH 3.5的条件下,1 min水解果胶产生1 μg还原糖(以半乳糖醛酸计算)所需的酶量。
1.2.2 黑曲霉EIM6原生质体的制备及再生取-80℃保藏的黑曲霉菌种1管,接种于PDA斜面培养基,28℃活化培养4~6 d。将生长旺盛的斜面孢子转接于液体PDA培养基,28℃培养20 h,用擦镜纸过滤收集菌丝。将菌丝置于Φ=6 cm培养皿中,添加1.5%溶壁酶和1.5%纤维素酶于30℃、60 r/min摇床上进行酶解2 h制备原生质体[11],4 000 r/min离心5 min,高渗稳定剂洗涤重悬获得106cfu/mL的原生质体悬液。
1.2.3 黑曲霉原生质体UV诱变取5 mL原生质体悬液于Φ=6 cm的培养皿中,置于磁力搅拌器上于15 W紫外灯下30 cm处进行诱变。分别于30、60、90、120、150、180、210、240 s时间点取样,用双层平板法再生,计算致死率。
1.2.4 黑曲霉原生质体NTG诱变将原生质体悬液分别用不同浓度NTG诱变处理30 min,浓度分别为0、25、50、100、150、200、250、300、350 μg/mL,诱变后用双层平板法再生,计算致死率。
1.2.5 高产突变株的初筛和复筛将再生后的单菌落移至初筛平板静置8 h,刚果红染色30 min,1 mol/L NaCl溶液浸泡1h,挑取透明圈较大的菌落到斜面培养基上培养纯化[9]。挑取初筛菌的成熟孢子至30 mL发酵培养基中进行发酵复筛。接种量为107cfu/mL,发酵条件为28℃,250 r/min,培养80 h后测定发酵液中果胶酶活力。
1.2.6 突变株遗传稳定性分析将经UV和NTG诱变筛选获得酶活力最高的2个菌株经8次连续传代培养,测定其果胶酶活力,分析果胶酶高产突变株的遗传稳定性。
2 结果与分析
2.1 制备原生质体
黑曲霉菌丝体在酶的作用下,菌丝断裂形成原生质体。酶解1 h,大部分菌丝断裂成小段,形成部分原生质体(图1a所示);酶解2 h,大量原生质体产生(图1b所示)。因此,选用酶解2 h制备形成的原生质体进行诱变实验。
图1 黑曲霉EIM6原生质体释放过程Fig.1 Protoplast release from Aspergillus niger EIM6
2.2 原生质体UV诱变突变株筛选
紫外照射的时间和致死率成正比,0~50 s内随着紫外照射时间延长原生质体死亡率迅速上升(图2),据报道[12]采用70%~80%致死率的原生质体正突变率较高。本实验采用25 s的UV(75%致死率)诱变来筛选果胶酶高产突变株。
双层平板法进行原生质体再生,随机挑选1 000个再生菌株转接于初筛平板(图3),选取透明圈最大的25个单菌落进行复筛。摇瓶复筛表明,15个突变株的果胶酶活力均有不同程度的提高,其中EIM6-U11酶活力最高,可达69 347.3 U/mL,比出发菌株提高了48.82%(图4)。
2.3 原生质体NTG诱变突变株筛选
NTG的浓度和致死率成正比,随着NTG浓度的增加,原生质体的致死率迅速上升(图5)。本实验采用浓度为50 μg/mL NTG诱变原生质体来筛选果胶酶高产突变株。
图5 NTG诱变致死率Fig.5 The lethality rate of protoplasts from Aspergillus niger EIM6 mutagenesis by NTG
NTG诱变筛选方法和紫外诱变筛选方法相同,从再生培养平板的单菌落中,用打琼脂块法挑取约1 000株诱变株于初筛平板上,染色洗脱后挑取透明圈较大的15个单菌落,转接至PDA斜面进行培养,3 d后接种至复筛发酵产酶培养基中进行发酵和测酶活力(图6)。
图6 NTG诱变果胶酶高产菌株Fig.6 High pectinase production strain from mutagenesis by NTG
2.4 高产菌株EIM6-U11、EIM6-N5传代稳定性
为了分析突变株的遗传稳定性,将其连续传代8次,然后分别测定其果胶酶活力,结果见表1。表1表明,在95%置信范围内,高产突变株EIM6-U11和EIM6-N5的酶活力和后代酶活力值相近,差异不显著(P>0.05),可见突变株EIM6-U11和EIM6-N5具有较高的遗传稳定性。
表1 突变株EIM6-U11和EIM6-N5的遗传稳定性Table 1 The genetic stability of EIM6-U11 and EIM6-N5
3 结论与讨论
原生质体一般是用对数生长期的细胞制备而来,其代谢旺盛、复制频繁。由于原生质体剥去了细胞壁,对诱变剂敏感性较强,往往正突变率高,并且诱变后易于形成单菌落而便于筛选,所以本实验对黑曲霉EIM6原生质体进行UV和NTG诱变来选育果胶酶高产突变株。实验表明黑曲霉EIM6的原生质体对UV和NTG比较敏感,采用原生质体诱变技术选育EIM6果胶酶高产突变株可行。诱变后进行果胶酶高产突变株的筛选,挑取生长较快和菌落直径较大的单菌落进行透明圈法初筛,并且通过DNS法定量测定发现菌株透明圈大小与酶活力成正比关系,说明此初筛方法稳定且有高通量性。原生质体进行UV和NTG诱变后获得2株果胶酶活力明显提高的突变株:EIM6-U11和EIM6-N5,果胶酶活力分别为68 596.57 U/mL和68 879.56 U/mL。本实验得到的突变株产果胶酶水平在国内选育研究中处于较高水平,并可对其进一步改造提高产酶水平。此外,由于固态发酵产果胶酶于深层液体发酵相比,有酶活力高、发酵成本低的优点,国内果胶酶的工业生产领域中,固体发酵生产方式占主导地位,所以还可以通过对EIM6-U11和EIM6-N5固体发酵条件优化进一步提高果胶酶产量。
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