高效液相色谱法测定畜禽组织中的三聚氰胺

张静 李云 赵立军 林顺全

(农业部畜禽产品质量安全监督检验测试中心 四川成都 610041)

1 前言

三聚氰胺 (melamine)简称三胺,学名三氨三嗪,别名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺,是一种用途广泛的有机化工原料,包括用于蒸煮器具和餐具,有些国家也批准用于化肥,但世界上没有任何国家批准其用于人类或动物食品。三聚氰胺含氮量高达 66%,一些不法个人和企业为达到提高产品蛋白质检测含量的目的,在饲料和牛奶中非法添加以谋取利益,对养殖业的健康发展产生了不利影响,对人类健康也造成了严重威胁。2007年 3月美国宠物“毒粮”事件[1]和 2008年 9月我国三鹿“毒奶粉”事件均是由三聚氰胺引起,造成了重大的生命财产损失,也严重影响了“中国制造”的声誉。

人体摄入一定量的三聚氰胺会造成生殖系统损害,可导致肾结石,甚至膀胱癌。而人体摄入三聚氰胺的途径主要是通过食品,其中包括动物源食品,即畜禽组织。饲料中的三聚氰胺可以经食物链进入畜禽组织,再进入人体,这可能会给人类的健康带来不良影响。

现有的三聚氰胺检测方法的检测对象多为化工产品、饲料以及奶制品等,有电位滴定法[2]、酶联免疫分析法[3]、高效液相色谱法[4-7]、毛细管电泳法[8]、气相色谱质谱法[9]、高效液相色谱串联质谱法[10-11]。本文经试验摸索,建立了畜禽组织中三聚氰胺的高效液相色谱法,针对畜禽产品中脂肪和蛋白含量较高的特点,增加了脱脂和除蛋白步骤,优化了净化条件,避免了此类高脂肪蛋白含量的样品对色谱柱的伤害,方法简便、准确,将对三聚氰胺的检测范围扩展到畜禽组织,所采用的高效液相色谱法对畜禽组织中三聚氰胺进行检测在国内尚无相关报道,这对保障我国畜产品质量安全和国民健康具有重要的意义。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 仪器

Agilent 1200高效液相色谱仪,配有紫外检测器。实验室用绞碎机;DENVER分析天平;H ITACH I离心机;M I LL IPORE超纯水器;IKA T10均质器;XH-B型涡旋混合器;IKA HS501振荡器;带盖塑料离心管;N-EAP 112氮吹仪;Waters OasisMCX固相萃取小柱;Agilent固相萃取装置。

2.1.2 试剂

三聚氰胺标准品 (Dr Ehrenstorfer GmbH);甲醇(色谱纯);乙腈 (色谱纯);辛烷磺酸钠 (色谱纯);柠檬酸 (色谱纯);三氯乙酸 (分析纯);乙酸铅 (分析纯);氨水 (分析纯);超纯水等。

2.2 方法

2.2.1 标准溶液的制备

2.2.1.1 标准贮备液

称取 100mg(精确到 0.1mg)的三聚氰胺标准品,用甲醇溶解并定容于 100mL容量瓶中,配制成浓度为 1mg/mL的贮备液,于 2℃ -8℃冰箱内保存。

2.2.1.2 标准工作液

准确量取适量标准贮备液于容量瓶中,用流动相溶液稀释,定容,分别配制成浓度为 2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、100.0μg/mL、200.0μg/mL的标准工作液。置于 2℃-8℃冰箱中保存。

2.2.2 色谱条件

色谱柱:Agilent Eclispe XDB C18柱 (柱长150mm,内径 4.6mm,粒度 5μm);检测波长:240nm;柱温:30℃;流动相:(0.01mol/L辛烷磺酸钠+0.01mol/L柠檬酸):乙腈 =90:10;流速:1.0mL/min;进样体积 :20μL。

2.2.3 样品的制备

2.2.3.1 提取

称取试样 2g(精确至 0.01g)于带盖塑料离心管,加入约 25mL乙醚,均质,摇床上振荡 20min,弃去乙醚,重复以上步骤一次。准确加入 18mL三氯乙酸溶液和 2mL乙酸铅溶液,摇匀,均质,涡旋提取2min,在 10000r/min离心机上离心 5min,上清液备用。

2.2.3.2 净化

分别用 3mL甲醇,3mL水活化混合型阳离子交换固相萃取柱,准确移取 10mL上清液分次上柱,控制过柱速度在 1mL/min以内。再用 3mL水和 3mL甲醇洗涤混合型阳离子交换固相萃取柱,抽近干后用 5%氨水甲醇溶液 6mL洗脱。洗脱液 50℃氮气吹干,准确加入流动相溶液 1.0mL,涡旋振荡 30s,过 0.45?m滤膜,上机测定。

3 结果与分析

3.1 线性范围

将浓度分别为 2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、100.0μg/mL、200.0μg/mL的三聚氰胺标准工作液分别进样 20μL,以进样浓度 C(μg/mL)为横坐标,以峰面积 A为纵坐标,做标准曲线,计算回归方程和相关系数。实验测得三聚氰胺标准工作液在 2.0-200.0μg/mL浓度范围内的回归方程为 Y=82.025X+0.6012,相关系数 r=0.9998,表明具有良好的线性关系。

3.2 方法准确度和精密度

为考察方法的准确度和精密度,对空白猪肌肉、猪肝、鸡肉、鸭肉分别进行了加标回收试验,采用 3个不同水平的添加量,每个水平平行测定 6份。回收率测定结果见表 1,结果表明,平均回收率在72.9%-84.5%,RSD＜5%,方法准确度和精密度良好。

表 1 回收率试验结果

3.3 方法定量限

在本试验条件下,将一定量三聚氰胺标准溶液加入到空白样品中,经提取、净化后测定,根据信噪比(S/N)=10的峰响应值和样品前处理的稀释倍数,得出方法的定量限为 2 mg/kg,定量限浓度的样品色谱图见图 1。

图 1 定量限浓度的样品色谱图

4 讨论

4.1 流动相和色谱柱的选择

目前液相色谱法测定三聚氰胺选用的流动相和色谱柱主要有两种,根据所用的色谱柱选择相应的离子对试剂做流动相。若采用 C8柱,则用庚烷磺酸钠离子对试剂;若采用 C18柱,则用辛烷磺酸钠离子对试剂。采用两种色谱柱及相应的流动相,在相同的色谱条件下,测得三聚氰胺色谱峰响应相当,而三聚氰胺在 C18柱有更好保留。本实验最终选择更常用的 C18柱,经条件优化,最终选择乙腈:(0.01mo l/L辛烷磺酸钠与0.01mol/L柠檬酸)缓冲液以 10:90的比例作为分析用流动相。

4.2 检测波长的选择

将 5.0μg/mL浓度的三聚氰胺标准溶液在 200-400nm范围内进行紫外扫描,光谱图见图 2。显示三聚氰胺在约 240nm处有最大吸收,故选择240nm最为检测波长,这也与大多数文献报道的检测波长一致。

图 2 三聚氰胺紫外光谱图

4.3 提取、净化条件的选择

三聚氰胺为弱碱性化合物,其在酸性水溶液中易溶,采用三氯乙酸进行提取效果良好。由于畜禽组织中含有大量脂肪和蛋白质,容易对色谱柱造成损害,需预先除去。先后试验了正己烷脱脂、自制过三氧化二铝小柱脱脂和乙醚脱脂三种方法,经比较,用乙醚脱脂简便易行,且回收率较高。另外,添加适量饱和乙酸铅溶液能达到良好的除蛋白效果。

三聚氰胺在酸性条件下成阳离子状态,采用MCX柱 (阳离子交换小柱)净化,专属性较高,净化效果明显。试验对淋洗、洗脱溶剂及体积进行了优化,根据MCX小柱的推荐方法,依次采用水、甲醇对小柱进行淋洗,采用碱性溶剂氨化甲醇进行洗脱。分别试验了 2%-10%氨化甲醇的洗脱效率,结果表明采用 6mL5%的氨化甲醇洗脱回收率最高。

5 结论

本文建立了高效液相色谱测定畜禽组织中三聚氰胺的实验方法。所样品前处理操作简单,易于掌握。方法经验证具有较高的灵敏度、准确度和精密度,可以满足分析要求,适用于畜禽组织中三聚氰胺的检测。

[1] U.S.Food and Drug Administration:Interim melamine and analogues safety/risk assess ment[EB/OL].

[2] 袁立勇,马朝卫,杜亚辉.溶液中三聚氰胺含量的快速测定[J].河南化工,2004,4:42.

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[5] 辜雪英,吴小花,仇满珍.饲料中三聚氰胺残留量高效液相色谱测定的研究[J].江西化期检验工,,2007,2:70-73.

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