RP-HPLC法同时测定中药关白附中关附甲素、关附壬素和关附辛素含量

吴 琼， 杨春华， 刘静涵， 秦民坚*

(1.中国药科大学中药资源教研室，江苏 南京210009;2.中国药科大学天然药物化学教研室，江苏南京210009;3.中国药科大学分析测试中心，江苏南京210009;4.教育部药物质量与安全预警重点实验室，江苏南京210009)

关白附为毛茛科乌头属植物黄花乌头(Aconitum coreanum(Lèvl)Rapaics)的块根，为常用中药，具有祛风、燥湿、化痰、止痛等功效。其主要活性成分为二萜生物碱，迄今已分离得到其中28个二萜生物碱，包括25个C20和3个C19二萜生物碱，其中关附甲素(GFA，1)为叔胺类C20Hetisine型二萜生物碱，有抗多种实验性心率失常作用，并已进入我国一类新药的Ⅳ期临床实验［1-4］;关附壬素(GFI，2)为其另一含量较高的二萜生物碱，与GFA相比，具有相同的母核，但酰基数目较少，活性较弱［5-6］;关附辛素(GFH，3)为水溶性Atisine型生物碱，又名atisine chloride［7］，能抑制骨骼肌系统和呼吸系统，具高毒性，对小鼠的LD50为9.0 mg·kg-1［8］，且其在关白附药材中含量较高，是药材质量控制的指标性成分之一。本文首次采用反相高效液相色谱法同时对关白附中3种生物碱——GFA、GFI和GFH进行含量测定，获得满意结果，为药材质量控制提供了实验依据。

1 仪器与材料

Agilent 1100 system(G1311A四元梯度泵，G1313A自动进样器，G1315B-DAD二极管阵列检测器，Agilent公司);Agilent色谱工作站;AE240分析天平(METTLER公司);0412-1离心机(上海手术器械厂);KQ-250DE型医用数控超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司);RT-02药材粉碎机(浙江武义屹立工具有限公司)。

乙腈(色谱纯，Merck公司);磷酸，三乙胺(分析纯，南京化学试剂厂);纯净水(乐百氏公司);GFA、GFI、GFH对照品(自制，结构经UV、IR、NMR、MS鉴定，纯度经HPLC峰面积归一化法测得大于98%)。

关白附药材样品(批号0701～0705，为2007年10月中旬采收的3年生药材;批号0801～0805，为2008年10月中旬采收的2年生药材)，由吉林敖东洮南药业提供，中国药科大学中药学院秦民坚教授鉴定为毛茛科乌头属植物黄花乌头的块根。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Zorbax Eclipse XDB-C8柱(2.1 mm×150 mm，5μm);流动相A:0.2%庚烷磺酸钠缓冲液(加入0.2%三乙胺，磷酸调至pH 3)，流动相B:乙腈;梯度洗脱:流动相B体积分数在0～10 min时为10%，10～25 min时为10%～17%，25～60 min时为32%;流速:0.2 mL·min-1;检测波长:205 nm;柱温:25℃;进样量:10μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取对照品GFI 24.8 mg、GFA 25.2 mg、GFH 25.0 mg，分别置50 mL量瓶内，用流动相A溶解并定容，摇匀，制得GFI(0.496 g·L-1)、GFA(0.504 g·L-1)和GFH (0.500 g·L-1)的对照品储备液。取对照品 GFI储备液2.5 mL、GFA储备液2.5 mL和GFH储备液5.0 mL，分别置5 mL量瓶中，加流动相A稀释，即得GFI(0.248 g·L-1)、GFA(0.252 g·L-1)和GFH(0.500 g·L-1)的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取关白附药材样品粉末约2 g，过24目筛(孔径为0.8 mm)，精密称重，加入50 mL 1%HCl，称重，80 Hz超声30分钟，放冷，加入1%HCl补足失重，摇匀，移取4 mL置离心管，离心(4 000 r·min-1)30 min，移取上清液，过0.45μm微孔滤膜，即得。

2.3 系统适用性试验

按“2.1”项下色谱条件，取供试品溶液，进样，记录色谱图(见图1)。结果测得，理论塔板数以GFI计不低于10000;3种生物碱色谱峰的对称因子在0.95～1.05之间，其相邻色谱峰的分离度大于1.5。

图1 供试品溶液色谱图Figure 1 Chromatogram of sample solution

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 精密量取各对照品储备液2、4、6、8、10 mL，分别置10 mL量瓶中，以流动相A稀释定容，制成系列标准溶液，进样，记录色谱图。以峰面积(A)为纵坐标，质量浓度(C)为横坐标，进行回归计算，分别得GFI、GFA和GFH的回归方程: AGFI=5.0×103C+1.8×102(r=0.999 9)，AGFA= 4.0×103C-1.5×102(r=0.999 9)，AGFH=8.2×103C-3.7×102(r=1.000);其质量浓度线性范围分别为:0.100～0.502 g·L-1，0.100～0.498 g·L-1，0.100～0.500 g·L-1。

2.4.2 重复性试验 取同一批次关白附药材样品(批号:0805)6份，分别按“2.2.2”项下操作，制成供试品溶液，进样，记录色谱图。结果测得，关白附药材中GFI、GFA和GFH含量的RSD(n=6)分别为1.20%、1.85%和1.41%，其保留时间的RSD(n= 6)均小于0.5%。表明此方法重复性良好。

2.4.3 精密度试验 取关白附药材样品(批号: 0801)1份，同法制成供试品溶液，连续进样6次，记录色谱图。结果测得，关白附药材中GFI、GFA和GFH含量的RSD(n=6)分别为0.11%、0.23%和 0.14%，其保留时间的RSD(n=6)均小于0.5%。表明此方法精密度良好。

2.4.4 稳定性试验 取关白附药材样品(批号: 0801)1份，同法制成供试品溶液，分别在室温放置0、6、12、18、24 h时，进样，记录色谱图。结果测得，在不同时间点的GFI、GFA和GFH峰面积的RSD (n=5)分别为0.42%、1.27%和0.18%，其保留时间的RSD(n=5)均小于0.5%。表明供试品溶液在室温放置24 h内稳定。

2.4.5 回收率试验 取已知含量的同一批次关白附药材样品(批号:0702)约1 g，共9份，精密称定，每3份样品中分别加入混合对照品溶液［含GFI(4.75 g·L-1)、GFA(7.01 g·L-1)和 GFH (8.90 g·L-1)］0.80、1.00和1.20 mL，同法制成供试品溶液，进样，记录色谱图。结果测得，关白附药材中GFI、GFA和GFH的平均加样回收率分别为97.29%、101.46%和102.33%，RSD(n= 9)分别为3.29%、1.40%和2.42%。

2.5 样品测定 称取不同批次的关白附药材样品适量，同法制得供试品溶液，同时取“2.2.1”项下各对照品溶液，分别进样，记录色谱图，平行操作3次。取平均值，按外标法计算样品平均含量，结果见表1。

表1 样品含量测定结果(mg·g-1，±s，n=3)Table1 Results of the content determination for samples

表1 样品含量测定结果(mg·g-1，±s，n=3)Table1 Results of the content determination for samples

样品批号GFI GFA GFH 0701 5.13±0.09 8.20±0.08 9.43±0.12 0702 5.05±0.04 7.10±0.08 8.53±0.10 0703 5.11±0.04 7.95±0.05 8.04±0.12 0704 5.59±0.04 8.65±0.02 10.08±0.18 0705 4.75±0.10 7.94±0.18 8.93±0.24 0801 5.25±0.06 5.76±0.11 6.27±0.09 0802 5.36±0.02 5.42±0.06 6.36±0.03 0803 5.96±0.11 5.94±0.05 5.94±0.03 0804 5.37±0.10 5.56±0.03 6.66±0.12 ___0805_______4.29±0.07___6.33±0.1___________________ 65.81±0.08

3 讨论

本文采用超声方法［9］，提取关白附中的主要成分二萜生物碱，发现其2年生与3年生药材中GFI、GFA、GFH含量存在明显差异，其中批号为0803的样品中GFI含量最高，批号为0704的样品中GFA和GFH含量最高。即总体来说，3年生药材中，GFA和GFH含量明显高于2年生药材，总碱含量也较高，这揭示了民间多采用3年生药材的块根入药的原因。

目前文献报道的关白附质量控制方法大多采用指纹图谱考查及GFA的HPLC法含量测定［10］，而尚未见同时测定活性成分GFA与强毒性成分GFH含量的报道。众所周知，中药起效的物质基础极其复杂，对单一活性成分的测定不能说明药材的效用本质。本文通过对关白附中3种二萜生物碱的含量测定，发现同批次药材中GFH含量大多高于GFA含量。因此，可对药材进行适当的炮制或有效的提取制备，减少其中毒性成分的含量，从而达到控制药材质量和安全用药的目的。

本文所建立的同时测定3种生物碱——GFI、GFA和GFH的HPLC法，线性范围宽，重复性好，可用于关白附药材的质量控制。

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