缝隙连接在同型半胱氨酸介导的高血压大鼠血管平滑肌细胞增殖中的作用

王恩帮，钟华，罗小林，梁霄，邓峰美，司军强，何芳

（石河子大学医学院／新疆地方与民族高发病教育部重点实验室，石河子832002）

血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMCs）增殖、迁移和表型的变化导致的血管壁增厚和血管紧张度的增加是高血压发病的关键。由缝隙连接蛋白（connexin，Cx）构成的直接通讯－缝隙连接（gap junction，GJ）在调节血管舒缩、血管平滑肌细胞增殖、平滑肌的表型转变中起着重要作用，并与高血压发生密切相关［1］。我们及其他学者前期的研究发现同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）血浆水平升高使HUVEC中内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）活性减弱、一氧化氮（nitric oxide，NO）含量降低，并削弱了 NO的血管舒张作用，增加氧化应激，刺激血管平滑机细胞增生，改变血管壁弹性，增加血管阻力，因此促成血压升高［2－3］，GJ是否参与了 Hcy介导的高血压大鼠VSMCs增殖效应尚不清楚。因此，本文以体外培养自发性高血压大鼠VSMCs为研究对象，初步探讨了缝隙连接在Hcy介导的高血压大鼠VSMCs增殖中的作用。

1 材料与方法

1．1 取材、细胞培养及VSMCs的鉴定

依据本研究室以前的方法培养VSMCs［4］，并对其细胞形态学及α－平滑肌肌动蛋白（α－action）抗体进行免疫细胞化学染色鉴定，取3～5代细胞用于实验。

1．2 MTT法检测不同浓度Hcy对自发性高血压大鼠VSMCs增殖的影响

制备细胞悬液。用含10%FBS的DMEM液稀释成5×104个cell／mL，接种于96孔板，每孔加入200μL混匀后的细胞悬液，置于37℃，5%CO2恒温培养箱中孵育24h。弃去培养液，用PBS液冲洗1～2遍。每孔加入不含FBS的DMEM液，各200 μL，继续培养24h，使细胞同步于G0／G1期。弃去培养液，分别按以下分组加入试剂：分为5组，每组10个复孔，（1）：对照组，加200μL含2%FBS的DMEM液；（2）：不同浓度Hcy处理组，分别加入含Hcy浓度为 0．025mmol／L、0．05mmol／L、0．1 mmol／L、0．2mmol／L、0．5mmol／L 及2%FBS的DMEM液，置于培养箱培养24h，各组弃去培养液，每孔加入 MTT20μL，孵育4h，加入DMSO150 μL，于酶标仪上检测各孔570nm处吸光度（A值）。

1．3 MTT法检测缝隙连接在Hcy介导的自发性高血压大鼠VSMCs增殖中的作用

制备细胞悬液。用含10%FBS的DMEM液稀释成5×104个cell／mL，接种于96孔板，每孔加入200μL混匀后的细胞悬液，置于37℃，5%CO2恒温培养箱中孵育24h。弃去培养液，用PBS液冲洗1～2遍。每孔加入不含FBS的DMEM液，各200μL，继续培养24h，使细胞同步于G0／G1期。弃去培养液，分别按以下分组加入试剂。分4组，每组10个复孔，分别如下：（1）：对照组，自发性高血压大鼠VSMCs，加200μL含2%FBS的DMEM液；（2）：Hcy处理组，自发性高血压大鼠VSMCs加入含Hcy浓度为0．05mmol／L及2%FBS的DMEM液；（3）：缝隙连接阻断剂组（18α－GA），自发性高血压大鼠 VSMCs加入18α－GA使其终浓度为50 μmol／L，置于培养箱培养24h；（4）：缝隙连接阻断剂＋Hcy组（Hcy＋18α－GA），自发性高血压大鼠VSMCs加入含 Hcy浓度为0．05mmol／L及2%FBS的DMEM 液，使得18α－GA终浓度50μmol／L。各组弃去培养液，每孔加入MTT20μL，孵育4 h，加入DMSO150μL，于酶标仪上检测各孔570nm处吸光度（A值）。

1．4 统计学处理

用SPSS13．0软件进行统计分析。数据以¯X±S示，应用单因素方差分析和t检验。P＜0．05表示差异有统计学意义。

2 结果

2．1 不同浓度Hcy对自发性高血压大鼠VSMCs增值的影响（表1）

用不同浓度的Hcy刺激正常大鼠血管平滑肌细胞24h，结果见表1和图1。

表1 不同浓度Hcy对自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞增值作用±S，n＝10 Tab．1The effects of different concentrations Hcy on the VSMCs proliferation in the spontaneouslyhypertensive rats

表1 不同浓度Hcy对自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞增值作用±S，n＝10 Tab．1The effects of different concentrations Hcy on the VSMCs proliferation in the spontaneouslyhypertensive rats

注：＊P＜0．05，与对照组比较。

组别 A570 0．37±0．04 Hcy（0．025mmol／L） 0．44±0．06＊Hcy（0．05mmol／L） 0．44±0．02＊Hcy（0．1mmol／L） 0．43±0．03 Hcy（0．2mmol／L） 0．41±0．05 Hcy（0．5mmol／L）对照组0．40±0．04

表1和图1显示：当Hcy浓度为0．1mmol／L、0．2mmol／L、0．5mmol／L时，所测的 A 值与对照组相比差异无统计学意义（P＞0．05）；Hcy浓度为0．025mmol／L、0．05mmol／L时测得 A 值显著高于对照组（P＜0．05）；Hcy浓度0．05mmol／L 组与0．025mmol／L组相比，A值无显著差异（P＞0．05）。

图1 不同浓度Hcy刺激对自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞增殖作用Fig．1The effects of different concentrations Hcy on the VSMCs proliferation in the spontaneously hypertensive rats

2．2 缝隙连接在Hcy介导的自发性高血压大鼠VSMCs增殖中的作用

经过不同处理因素作用24h后，结果（表2，图2）显示：与对照组相比，Hcy组A值显著升高，缝隙连接阻断剂（18α－GA）组显著降低（P＜0．05），Hcy＋18α－GA组与对照组相比无显著差异（P＞0．05）；18α－GA组A值明显低于 Hcy组（P＜0．05），Hcy＋18α－GA组测得A值明显低于Hcy组，高于18α－GA组（P＜0．05）。

表2 缝隙连接在Hcy介导的自发性高血压大鼠VSMCs增殖中的作用±S，n＝10 Tab．2The roles of gap junctions in Hcy mediated VSMCs proliferation in the spontaneously hypertensive rats

表2 缝隙连接在Hcy介导的自发性高血压大鼠VSMCs增殖中的作用±S，n＝10 Tab．2The roles of gap junctions in Hcy mediated VSMCs proliferation in the spontaneously hypertensive rats

注：﹡P＜0．05，与对照组比较；△P＜0．05，与 Hcy组比较；＃P＜0．05，与18α－GA组比较。

组别 A570 0．37±0．04 Hcy（0．05mmol／L） 0．44±0．02＊18α－GA（50μmol／L） 0．27±0．02＊Hcy＋18α－GA 0．30±0．05＃△对照组

图2 缝隙连接在Hcy介导的自发性高血压大鼠VSMCs增殖中的作用Fig．2The roles of gap junctions in Hcy mediated VSMCs proliferation in the spontaneously hypertensive rats

3 讨论

近来的研究表明高同型半胱氨酸血症能够导致血管内皮损害，促进低密度脂蛋白的氧化、血小板的聚集、血管平滑肌细胞增殖，对正常大鼠VSMCs的作用由于细胞密度，Hcy浓度的不同而不同。研究发现一定剂量的Hcy能诱导自发性高血压大鼠VSMCs的增殖［5－6］，本文通过 MTT法检测 Hcy对体外培养的自发性高血压大鼠胸主动脉平滑肌细胞增殖的影响发现：Hcy浓度在0．025，0．05mmol／L时血管平滑肌细胞增殖增加明显，当Hcy浓度＞0．1mmol／L时，随着浓度的升高，细胞增殖增加明显开始降低，但与对照组相比细胞仍呈现增殖趋势。

缝隙连接（gap junction，GJ），又称间隙连接、通讯连接，是由连接相邻两个细胞之间的连接通道排列而成的一种特殊膜结构。细胞间的通讯方式可分为间接与直接方式。相邻细胞间通过缝隙连接所介导的细胞间的通讯为直接通讯，又称缝隙连接细胞间 通 讯 （gap junction inter－cellular communication，GJIC）。相邻细胞通过直接通讯进行信息、能量和物质交换，参与细胞间物质交换的代谢偶联和电信号传递的电偶联，对细胞的新陈代谢 内环境稳定、增殖和血管平滑肌舒缩等生理过程起着重要的调控作用。为了今后进一步研究Hcy血浆水平升高是否通过改变Cx的表达调节GJ的功能，影响细胞间直接通讯，并导致血管平滑肌细胞增殖，我们首先通过MTT法及缝隙连接阻断剂初步研究了缝隙连接在Hcy介导的自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞增殖中的作用。取生长自发性高血压大鼠VSMCs分4组加入不同的试剂：对照组，Hcy组，18α－GA组和 Hcy＋18α－GA组。结果发现，与对照组相比；Hcy组A值明显高于对照组，提示Hcy促进了自发性高血压大鼠VSMCs的增殖；18α－GA组低于对照组（P＜0．05）提示缝隙连接参与了自发性高血压大鼠VSMCs的增殖；Hcy＋18α－GA组A值明显低于 Hcy组而高于18α－GA组（P＜0．05），但与对照组相比无显著差异（P＞0．05）说明当缝隙连接阻断后，完全阻断了Hcy促进自发性高血压大鼠VSMCs增殖的效应；提示缝隙连接可能参与了Hcy介导的自发性高血压血管平滑肌细胞增殖作用。

总之，我们的研究初步证实，缝隙连接可能参与了Hcy介导的高血压大鼠血管平滑肌细胞增殖，但在各处理因素作用下自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞缝隙连接的蛋白表达又有何变化，缝隙连接功能有何变化，还有待进一步研究。该研究结果对进一步阐明Hcy在高血压等血管平滑肌细胞增殖相关疾病中的作用机制提供了重要理论依据，可为心脑血管疾病防治提供新靶标。

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［2］张会敏，张海洋，邓峰美，等．同型半胱氨酸对钙离子激活状态下内皮细胞eNOS活性及NO含量的影响［J］．石河子大学学报（自然科学版），2007，25（2）：196－199．

［3］Rodrigo R，Passalacqua W，Araya J，et al．Homocysteine and essential hypertension［J］．J Clin Pharmacol，2003，43（12）：1299－1306．

［4］钟华，黄刚，赵丹，等．ERK 通路对 TGF－β＿1介导的大鼠血管平滑肌细胞增殖的作用［J］．石河子大学学报（自然科学版），2008，26（1）：1－5．

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