布鲁氏菌M5－90ΔvirB2基因缺失株免疫小鼠抗体及相关细胞因子的检测研究

李臻，陈创夫，王远志，葛阳春，张红星，杨明锋，张辉

（1石河子大学生命科学学院，石河子832003；2石河子大学动物科技学院，石河子832003；3石河子大学医学院，石河子832003；4安阳市中医院，安阳455000）

布鲁氏菌病（brucellosis）是一种在全世界范围内都广泛分布的人畜共患传染病，此病近年来在我国也有逐步回升的趋势［1－2］。世界上170多个国家和地区有人、畜布鲁氏菌病的存在和流行。该病对我国的畜牧业影响较大，同时因其可以感染人类，严重危害了社会公共卫生安全［3］。该病具有慢性传染的特点，药物治疗效果较差，动物对该病的预防主要是通过接种疫苗来实现，目前人类对该病的预防尚无有效疫苗。现有的布鲁氏菌病疫苗种类主要有灭活疫苗、弱毒活疫苗、突变株疫苗等，其中弱毒活疫苗应用最为广泛。我国自主研制的羊型M5－90疫苗因其免疫效果好，可有效预防绵羊和山羊布鲁氏菌病。但是该疫苗毒力较强，可造成部分怀孕母畜流产，同时无法区分疫苗免疫和自然感染，从而限制了其在实际中的应用。因此研制一种毒力较弱、具有较好免疫原性，并能进行鉴别诊断的新型疫苗势在必行。

布鲁氏菌是一种特异性细胞内寄生菌，当其进入机体后，可在网状内皮系统（特别是在免疫系统的巨噬细胞、单核细胞）内生存［4］。它能够侵染具有杀菌活性的吞噬细胞，并在吞噬细胞内复制［5］。清除胞内菌的保护性免疫应答主要依赖于细胞免疫。Ⅳ型分泌系统是布鲁氏菌重要的毒力因子，由12个不同的蛋白构成的复合体，这些蛋白跨越细菌的细胞壁。virB2位于细菌表面，与细菌侵袭有密切关系［6］。

我们前期构建了布鲁氏菌 M5－90ΔvirB2基因缺失株［7］，通过敲除布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统中virB2基因，从而达到弱化M5－90毒力的目的。在本研究中，我们以该基因缺失株为研究对象［8］，通过抗体凝集试验和相关细胞因子水平的检测，初步分析该基因缺失株对免疫小鼠后的抗体水平及细胞因子的影响，从而为更深一步了解virB2基因在布鲁氏菌侵染机体过程中的作用，以期为研制新型布鲁氏菌疫苗提供科学依据。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 菌株

布鲁氏菌疫苗株 M5－90与 M5－90ΔvirB2基因缺失株均由本研究室保存。

1．1．2 培养基、试剂与主要试剂盒：

Brucella Broth培养基与Brucella Agar培养基均购自美国BD公司；布鲁氏菌标准试管凝集抗原购自中国疾病控制中心，布鲁氏菌病虎红平板凝集试验抗原购自青岛易邦生物工程有限公司；小鼠IL－2、IL－4、IL－6、IL－10、TNF－αELISA 试剂盒均购自上海依科赛生物制品有限公司。

1．1．3 实验动物

BALB／c小鼠购自石河子大学实验动物中心。

1．2 方法

1．2．1 抗体水平检测

1．2．1．1 标准试管凝集试验（SAT）

按照标准布鲁氏菌试管凝集试验（国标号：GB15988－1995）操作进行。全部试管充分震荡后，置于37℃温箱中，22－24h后观察结果。

1．2．1．2 虎红平板凝集试验（RBPT）

分别吸取30μL的小鼠外周血清和虎红平板凝集试验抗原，均匀混合涂于玻璃板上，4min内观察试验结果。

1．2．2 细胞因子水平检测

选取6－8周龄大小的BALB／c小鼠将其分为3组，每组各24只。对目标试验组小鼠接种 M5－90ΔvirB2疫苗株，阳性对照组接种 M5－90疫苗株，阴性对照组注射PBS磷酸缓冲液。免疫剂量均为1×106CFU／只（0．2mL／只）。采用腹腔注射，免疫次数为1次。分别在免疫后的第1、2、3、4周对小鼠进行尾部采血，6000r／min离心5min，分离血清于－80℃存放待用。按照ELISA试剂盒的操作步骤对收集到的小鼠外周血清分别进行细胞因子IL－2、IL－4、IL－6、IL－10、TNF－α检测。

2 结果

2．1 SAT与RBPT试验

分别用 M5－90和 M5－90ΔvirB2免疫小鼠后收集的血清进行SAT和RBPT试验，试验结果如表1所示。

表1 SAT与RBPT验证结果Tab．1The results of SAT and RBPT

2．2 细胞因子检测试验

分别在接种后的第1、2、3、4周对小鼠进行断尾采血，到第5周时，将收集到的小鼠外周血清按1∶2稀释后进行细胞因子IL－2、IL－4、IL－6、IL－10、TNF－α的双抗体夹心ELISA方法检测。

IL－2的检测结果显示，前3周由 M5－90ΔvirB2诱导产生的IL－2水平低于 M5－90，到第4周，这种水平发生了变化，M5－90ΔvirB2产生的IL－2水平高于M5－90，且均高于PBS诱导产生的IL－2水平（图1）。

IL－4的检测结果显示，前3周 M5－90与 M5－90ΔvirB2诱导产生的IL－4水平相当，第4周时M5－90ΔvirB2诱导水平下降，M5－90诱导水平保持平稳。

IL－6的检测结果显示，M5－90诱导的IL－6水平在第1周时最高，达到328pg／mL，以后逐周下降。M5－90ΔvirB2诱导水平在第2周时达到峰值，达到222．3pg／mL。

IL－10的检测结果显示，M5－90诱导的IL－10水平同样在第1周时最高，达到81．2pg／mL，而 M5－90ΔvirB2诱导产生IL－10的水平较低，且始终低于M5－90。

TNF－α的检测结果显示，由 M5－90诱导的TNF－α水平比同期 M5－90ΔvirB2诱导的都要高，M5－90ΔvirB2在第4周时下降明显。

图1 M5、M5－90ΔvirB2和PBS免疫后小鼠外周血IL分子和TNF－α水平Fig．1Content of IL and TNF－αin serum from miceimmunized by M5，M5－90ΔvirB2and PBS

3 讨论

在整个布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统中，virB2基因对布氏杆菌在机体内的存活具有重要作用。M5－90ΔvirB2基因缺失株的成功构建，为我们接下来研究该基因的功能，以及对此缺失株的相关免疫学评价均奠定了基础。对该基因缺失株毒力的研究发现，在相同情况下用相同剂量1×108CFU接种小鼠后，接种了基因缺失株的小鼠死亡率要明显低于M5－90［7］。

试管凝集试验和虎红平板凝集试验均是布鲁氏菌病常用的血清学检测方法，同时试管凝集试验也可作为一种半定量的试验方法来粗略的测定感染或免疫血清中的抗体效价。在本研究中，上述2种试验的结果均反映出了基因缺失株刺激机体产生的抗体水平要弱于亲本株 M5－90。这可能的原因是virB2基因位于布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统的表面，并且在Ⅳ型分泌系统的组装过程中起着重要作用［9］，将该基因缺失后，可能会阻碍其胞内分泌蛋白的释放，从而影响布鲁氏菌相关免疫显性抗原的正常表达；同时也可能是因为由于羊是布鲁氏菌的易感物种，以小鼠为模型不能很好的展示本底动物的效果。

布鲁氏菌是一种胞内寄生菌。因感染前期产生的特异性抗体无法进入细胞或胞内菌中，因此清除胞内菌的保护性免疫应答主要依赖于细胞免疫［10］，即在布鲁氏菌的刺激下，可引起Th细胞分化为Th1［11］，Th1细胞在宿主抗胞内病原体感染时起重要作用，即对胞内病原体可通过活化巨噬细胞及释放各种活性因子而加以清除。细胞因子IL－2是由CD4＋Th1细胞分化产生，是T细胞激活并进入细胞分裂的关键成分，而T细胞的活化又制约着整个特异性免疫应答，包括细胞免疫和体液免疫。因而IL－2的激活和表达在T细胞活化中发挥关键作用。从研究结果来看，亲本株和基因缺失株均能刺激机体的IL－2水平上调，说明了二者均能刺激机体产生特异性的细胞免疫反应，但是缺失株的这种能力弱于亲本株，这可能因为亲本株毒力较强，从而可以更多的刺激机体的防御体制来清除病原体。而缺失株则因为毒力较亲本株弱，则在刺激机体的细胞免疫方面要弱于或迟于亲本株。

TNF－α是由单核巨噬细胞产生，能活化巨噬细胞，增强其杀伤能力，刺激急性期反应。细胞因子TNF－α的检测结果表明，M5－90在诱导机体产生TNF－α的能力要强于 M5－90ΔvirB2 缺失株的能力，说明在刺激机体产生保护性免疫方面，如Th1反应，M5－90ΔvirB2要弱于 M5－90。这可能是因为virB2基因缺失后，使布鲁氏菌的一系列分泌蛋白的运输通道发生了改变［12］，导致布鲁氏菌不能在巨噬细胞中持续存在，从而无法产生持续性的免疫应答。

IL－4、IL－6、IL－10是由 CD4＋Th2细胞经过活化、增殖和分化，进而分泌的细胞因子，能刺激B细胞的增殖、分化与成熟，从而促进抗体产生，增强抗体介导的体液免疫应答。IL－4与IL－10作用相似，它们均可刺激B淋巴细胞分化，促进抗体合成，并抑制Th1细胞分泌INF－γ，下调细胞免疫应答。从本研究的结果来看，M5－90与 M5－90ΔvirB2在刺激机体产生IL－4的能力相当，只是在第4周的时候M5－90ΔvirB2下降的比较明显。这可能说明缺失株无法在体内提供长期的免疫保护力。而IL－10的水平除了M5－90在第1周较高外，之后几乎都一直处于较低的水平。IL－6在宿主防御，急性期的反应和免疫反应过程中发挥重要作用。机体在受到细菌和病毒感染，外部损伤，自身免疫病的时候，血清中IL－6的水平会得到提高。在本研究中，免疫初期，M5－90诱导产生的IL－6水平明显高于同期的由M5－90ΔvirB2诱导产生的IL－6水平，但在之后 M5－90一直呈下调的趋势，而 M5－90ΔvirB2诱导产生的水平则在第2周升高，之后也保持下调趋势，且与M5－90相当。这可能是因为 M5－90的毒力介于缺失株和强毒株之间，在免疫初期，机体受到的刺激要高于缺失株带来的刺激，所以水平较高；之后M5－90疫苗株在机体内可被巨噬细胞吞噬，无法长期存活，从而诱导能力下降。而M5－90ΔvirB2缺失株在刺激机体产生免疫应答方面相比于M5－90表现出了一定时间的滞后，到第2周才检测到体内IL－6水平的升高。到第3周后逐渐下降，这可能与缺失株在体内的存活能力有关。

由于布鲁氏菌胞内寄生的特性，因此其在侵入机体后引发的Th1型反应会高于Th2型反应，也就是说其刺激机体产生的细胞免疫会高于体液免疫，这在之前国外及国内的研究中均有相似的报道［11，13］。本研究通过对免疫小鼠后抗体水平及相关细胞因子的检测，为今后对该基因缺失株更深一步的研究奠定基础。

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