非洲爪蟾驱动蛋白样蛋白 2靶蛋白 C'末端 SBP-3×Flag标记的 HCT 116结直肠癌细胞模型的建立

黄泽彬张泽延张晓东缪时英王琳芳杜润蕾

1中国医学科学院 北京协和医学院 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室,北京 100005 2武汉大学 生命科学学院细胞与发育生物学系,武汉 430072

非洲爪蟾驱动蛋白样蛋白 2靶蛋白 C'末端 SBP-3×Flag标记的 HCT 116结直肠癌细胞模型的建立

黄泽彬1,张泽延2,张晓东2,缪时英1,王琳芳1,杜润蕾2

1中国医学科学院 北京协和医学院 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室,北京 1000052武汉大学 生命科学学院细胞与发育生物学系,武汉 430072

目的建立非洲爪蟾驱动蛋白样蛋白 2靶蛋白 (TPX2)C'末端 SBP-3×Flag标记的 HCT 116结直肠癌细胞模型。方法PCR扩增同源臂,构建 TPX2的腺相关病毒打靶载体,包装病毒后打靶 HCT 116结直肠癌细胞,G418和PCR筛选获得含有新霉素抗性基因的阳性细胞株,最后通过 Cre病毒感染去除抗性基因,并用 PCR方法筛选获得 TPX2 C'末端 SBP和 3×Flag内源性双标签的 HCT116结直肠癌细胞株。结果筛选获得 2个含有新霉素抗性基因的细胞株,随后经 Cre病毒感染得到去除新霉素抗性基因的阳性细胞克隆,并经Western blot检测验证了 SBP-3×Flag基因的敲入。结论成功建立了 TPX2 C'末端 SBP-3×Flag标记的 HCT116结直肠癌细胞模型。

非洲爪蟾驱动蛋白样蛋白 2靶蛋白;基因敲入;同源重组;HCT116;结直肠癌

DO I:10.3881/j.issn.1000-503X.2011.06.008

结直肠癌是近年来发病率和死亡率上升最快的肿瘤之一[1],与其他肿瘤一样,是一种多基因参与的渐进积累转化性疾病,其发生、发展以及组织学分型均与其相关的癌基因、抑癌基因和一些生长因子及其遗传不稳定现象有关[2]。从分子水平探讨结直肠癌的发病机制,研究相关基因作用途径和寻找理想的分子靶标对其早期诊断、治疗和预后以及探索其基因治疗和进一步提高防治水平都具有重要意义。

非洲爪蟾驱动蛋白样蛋白 2靶蛋白 (targeting protein for Xenopus kinesin-like protein 2,TPX2)定位于人类染色体 20q11.2,是一个受细胞周期严格调控的核增殖蛋白,在细胞有丝分裂纺锤体形成过程中起重要作用[3]。TPX2与肿瘤的生物学行为有关,可在多种肿瘤中高表达,导致细胞中心体扩增、异倍体形成、基因组不稳定以及细胞恶性转化[4-5]。TPX2在结直肠癌中也高表达[6],但其在肠癌发生过程中的功能尚不清楚。为了揭示 TPX2在结直肠癌发生发展过程中的作用,本研究采用基因打靶技术,建立 TPX2 C'末端 SBP-3×Flag标记的 HCT 116结直肠癌细胞系,作为结直肠癌研究的模型。

材料和方法

材料 rAAV-pTK-Neo-LoxP-USER-SBP-3×Flag KI载体和 293T、HCT 116细胞株为本实验室保存,限制性内切酶、USER酶和高保真 pfu DNA聚合酶购自美国 NEB公司,质粒小提试剂盒购自德国 Qiagen公司,玻璃奶回收试剂盒购自博大泰克,DMEM和 IMDM培养基、胎牛血清和胰蛋白酶购自美国 Hyclone公司,Fugene转染试剂购自瑞士 Roche公司,抗生素新霉素 (G418)购自美国 Gibco公司,Flag抗体购自美国 Sigma公司,山羊抗小鼠 IgG购自中杉金桥。

载体构建 根据 rAAV-pTK-Neo-LoxP-USER-SBP-3×Flag KI载体序列和 TPX2基因组序列设计引物,以人基因组为模板通过 PCR方法分别扩增 5'同源臂和 3'同源臂 (又称左右臂),纯化后使用 USER酶连接至 rAAV-pTK-Neo-LoxP-USER-SBP-3×Flag KI载体并转化大肠杆菌 DH5α[7],随后通过菌落 PCR筛选阳性克隆,测序分析确认正确后提取质粒。设计的引物包括 TPX2同源臂引物 2对 (左右臂各 1对),新霉素测序引物、筛选引物和 Cre引物各 1对,如下:(1)左臂引物:上游:5'-GGGAAAGUCATAGGAAGGTTCCACGGACACA-3';下游:5'-GGAGACAUGCGCAGTGGAATCGAGTGGAGAA-3'。(2)右臂引物:上游:5'-GGTCCCAUACTCAGCTGTGAGCTGCGGATA-3';下游:5'-GGCATAGUGTGGTTACTGAGAGAGAGTTAACAGA-3'。(3)新霉素测序引物:上游:5'-TCGCCTTCTTGACGAGTTCT-3';下游:5'-GGGGTTTGCTCGACATTG-3'。(4)筛选引物:上游:5'-GCTATTGGCAGCTATTGGCATAGG-3';下游:5'-GGGAAGAAGGTACAGTCTGTGTGA-3'。 (5)Cre引物:上游:5'-CCCAAATTCTCCACTCGATTCCA-3';下游:5'-TGGGTTCTCTCCATGCCCAATGA-3'。

病毒包装及收获 转染前 1 d将 293T细胞传至 6孔板中培养,密度控制在 40%～80%;14～16 h内将 9μg质粒 DNA(pAAV打靶质粒、pAAV-RC和pAAV-Helper各 3μg)与 18μl Fugene转染试剂按照说明书混合孵育后加至 293T细胞中,轻轻摇匀后置于 37℃孵箱;72 h后收集病毒,并于 -80℃保存。

基因打靶 HCT 116细胞及筛选 将 HCT 116细胞传至 24孔板中培养,密度控制在 60%～80%,贴壁后加入 100～150μl病毒,轻轻摇匀后置于 37℃孵箱,48 h后用胰酶消化细胞,并改用含有 0.5 mg/ml新霉素的培养基将细胞按梯度 (倍比稀释)分至 4个 96孔板,置于 37℃孵箱培养 10～14 d后,于显微镜下挑取 96个单克隆,消化后转移到 1个新的 96孔板,置于 37℃孵箱培养约 2～3 d后消化细胞,取少量细胞提取基因组 DNA作为模板,通过 PCR方法筛选成功打靶的阳性克隆并转至 24孔板中继续培养。

Cre病毒感染去除抗性标记及筛选 在以上阳性克隆中挑选 2株状态最好的,各加入 10μl Cre病毒并继续培养,其余的阳性克隆加冻存液置 -80℃保存。细胞培养 24 h后用胰酶消化,各取 600～1200个细胞按梯度 (倍比稀释)分到 3个 96孔板中,37℃孵育 10 d后,于显微镜下各挑取 12个单克隆,2株即共 24个。消化后转移到 1个新的 96孔板,置于 37℃孵箱培养约 2～3 d后消化细胞,取少量细胞提取基因组DNA作为模板,通过 PCR方法筛选成功去除抗性标记的阳性克隆并转至24孔板中继续培养。待细胞密度约为 50%时,各挑取其中 3个阳性克隆,2株即共 6个,用胰酶消化后,把每个克隆分为 2份至6孔板中,其中一份于贴壁后改用含有 0.5 mg/ml新霉素的培养基进行培养,另一份仍用正常培养基培养作为对照,其余的阳性克隆加冻存液置 -80℃保存。10 d后,若用含新霉素的培养基进行培养的细胞死亡,则表明确实去除了新霉素抗性标记,获得阳性克隆。将正常培养基培养的阳性克隆各取 1个,2株即共 2个,用胰酶消化后,取一半扩大培养后冻存,另一半仍于 6孔板中培养,待长满后提取蛋白质验证 TPX2-SBP-3×Flag融合蛋白的表达,也即验证 TPX2 C'末端 SBP-3×Flag基因的敲入,其余的阳性克隆加冻存液置 -80℃保存。

W estern blot验证 收集上述 6孔板中培养的细胞并提取蛋白质,10%SDS-PAGE电泳分离蛋白质后,转印至 PVDF膜,以 TBST(TBS缓冲液 +1%Tween-20)配制的 5%脱脂牛奶室温封闭 1 h,1∶3000稀释的Flag和β-actin抗体 4℃下反应过夜,TBST洗膜后以1∶10000稀释的山羊抗小鼠 IgG室温反应 1 h,再次TBST洗膜后以化学发光法曝光显影。

结 果

载体构建 通过 PCR方法扩增出左右臂,连接至 rAAV-pTK-Neo-LoxP-USER-SBP-3×Flag KI载体并转化大肠杆菌,随后以菌落 PCR筛选出阳性克隆,并测序分析确认载体构建成功。

基因打靶 HCT 116细胞及筛选 包装的病毒打靶 HCT116细胞后挑取 96个单克隆,分别取少量细胞提取基因组DNA作为模板,以新霉素测序上游引物和筛选下游引物配对进行 PCR筛选,共筛选到 2个扩增条带正确的打靶阳性克隆 (图 1)。

Cre病毒感染去除抗性标记及筛选 将 2株阳性克隆传至 24孔板,经 Cre病毒感染后各挑取 12个单克隆,取少量细胞提取基因组 DNA作为模板,以Cre引物进行 PCR筛选,结果分别筛选到 7个和 10个去除新霉素抗性标记的阳性克隆 (图 2)。各挑取3个阳性克隆,进一步用新霉素筛选,10 d后细胞全部死亡。

图 1 PCR扩增筛选打靶阳性细胞克隆Fig 1 Screening for targeting positive cell clones by PCR amplification

图 2 PCR扩增筛选去除新霉素抗性标记的阳性细胞克隆Fig 2 Screening for positive cell clones with neomycin resistance marker being excised by PCR amplification

W estern blot验证 收集细胞并提取蛋白质进行Western blot验证,用 Flag抗体检测结果显示,2株细胞均可在相对分子质量 95 900附近检测到 TPX2-SBP-3×Flag融合蛋白的表达 (图 3)。

图 3 Western blot验证打靶阳性细胞克隆Fig 3 Verification of targeting positive cell clones byWestern blot analysis

讨 论

基因打靶是 20世纪 80年代发展起来的一项重要的分子生物学技术,是利用同源重组将外源基因定点整合到靶细胞基因组上某一确定位点,精细地定点修饰和改造目的基因 DNA片段,从而改变细胞遗传特性的技术[8]。该技术是研究基因结构功能最为有效而直接的方法之一,小鼠胚胎干细胞基因打靶技术的发展和基因打靶小鼠模型的建立,充分体现了该技术在基因结构功能研究中的价值。随着该技术的不断完善,在胚胎干细胞基因打靶技术的基础上逐步建立了体细胞基因打靶技术[9]。与胚胎干细胞基因打靶技术相比,体细胞基因打靶技术具有更为简便、周期更短、费用更低等多方面的优势。

本研究采用 Zhang等[10]报道的体细胞基因打靶技术,建立 TPX2 C'末端 SBP和 3×Flag内源性双标签的 HCT116结直肠癌细胞株。建立过程中,打靶效率高达 2.1%。Cre病毒感染后随机挑取 24个单克隆进行 PCR筛选,筛选到 17个去除新霉素抗性标记的阳性克隆,阳性率高达 70.8%。最后,通过Western blot技术在蛋白质水平验证了建立的细胞株可在相对分子质量 95 900附近检测到 TPX2-SBP-3×Flag融合蛋白的表达,表明成功建立了 TPX2 C'末端 SBP和3×Flag内源性双标签的 HCT116结直肠癌细胞株。

利用基因打靶技术进行基因功能及在传导通路中调控作用的研究是现代分子遗传学中先进的研究手段。通过基因打靶技术表位标记内源蛋白,很好地解决了蛋白功能研究中无抗体或抗体质量不好的问题[10]。该技术可以将 Flag等表位标签加在被研究的蛋白所在的基因组终止密码子上游,从而在生理表达水平表达带有 Flag等标签的目的蛋白,使 Flag抗体可以代替目的蛋白的抗体进行一系列的研究,许多基因/蛋白质功能研究方法变得更为简便,包括蛋白杂交、免疫沉淀、免疫荧光、染色质免疫沉淀微阵列、串联亲和纯化和质谱等。同时,Flag标签为通用标签,因此可使检测方法标准化。此外,该技术保证了所研究的蛋白仍处于正常生理状态,能够真实反映细胞内蛋白质之间的生理性相互作用模式,这是传统的过表达等研究方法没法做到的,因此在做串联亲和纯化结合质谱检测等实验时能保证较低的假阳性率。

构建基因打靶载体是关乎打靶成功与否的重要环节之一。由于DNA间发生同源重组的频率是很低的,因而打靶载体的选择和设计,同源臂长度的选择等方面都将直接影响基因打靶的效果。为成功建立打靶细胞系,本研究注意了以下几个方面的问题:(1)打靶载体的选择。人类基因组复杂,通过质粒转染的方法同源重组的效率非常低,而通过腺相关病毒 (adeno-associated virus,AAV)作为载体介导基因打靶可以大大提高重组效率[11-12],因此本研究选择了AAV载体。(2)载体同源臂长度的选择。载体上外源性同源序列的长度与同源重组的效率成正相关,同源序列长度从 4 kb增加到 9 kb,效率提高 40倍。通过腺病毒或质粒等传统的打靶载体与染色体靶位点进行有效的同源重组时,长度一般为 5～10 kb。尽管增加同源臂的长度能够提高重组效率,但同时也明显提高了同源臂 PCR扩增、克隆构建和打靶载体转入靶细胞的难度。然而AAV载体介导的打靶对同源臂长度的要求明显要低很多,同源臂的长度在1 kb以内就能进行有效的打靶,但同源臂长度的增加有助于提高重组效率[13]。因此本研究选择了适当的同源臂长度,左臂为 919 bp,右臂为 1191 bp。既保证了较高的打靶效率,又有利于同源臂的 PCR扩增、克隆和可以运用 PCR技术筛选同源重组的细胞克隆,有效地提高了效率。(3)DNA聚合酶的选择。为避免 PCR扩增同源臂过程中碱基发生突变,本研究采用了高保真的 pfu DNA聚合酶。此外,通过对重组片段的测序分析保证了载体插入同源臂的正确性。(4)克隆方法的选择。传统构建基因打靶载体方法依靠限制性内切酶和 T4 DNA连接酶,打靶位点的选择受到限制性内切酶位点的限制,因此通常不能直接操作感兴趣的区域。为此本研究采用了 USER酶进行连接的方法来构建基因打靶载体,该方法不依赖限制性内切酶,可以对基因组任意位置进行改造,很好地解决了以上困难。同时,大大简化了载体构建步骤,而且效率很高,可高通量构建体细胞基因打靶载体。

综上,通过体细胞基因打靶技术,本研究成功建立了 TPX2 C'末端 SBP-3×Flag标记的 HCT 116结直肠癌细胞模型,为研究 TPX2基因的功能奠定了基础。该技术有着很多的优点,相信随着其不断发展成熟,一定能发掘出更多的优点,从而促进该技术在基因功能研究甚至其他研究中更广泛的应用。

[1] Parkin DM,Bray F,Ferlay J,et al.Global cancer statistics,2002[J].CA Cancer J Clin,2005,55(2):74-108.

[2] Narayan S,Roy D.Role of APC and DNA mismatch repair genes in the development of colorectal cancers[J].Mol Cancer,2003,2:41.

[3] Trieselmann N,Armstrong S,Rauw J,et al.Ran modulates spindle assembly by regulating a subset of TPX2 and Kid activities includingAurora A activation[J].J Cell Sci,2003,116(Pt 23):4791-4798.

[4] Heidebrecht HJ,Buck F,Steinmann J,et al.p100:a novel proliferation-associated nuclear protein specifically restricted to cell cycle phases S,G2,and M[J].Blood,1997,90(1):226-233.

[5] Ma Y,Lin D,SunW,et al.Expression of targeting protein for Xklp2 associated with both malignant transformation of respiratory epithelium and progression of squamous cell lung cancer[J].Clin Cancer Res,2006,12(4):1121-1127.

[6] Carvalho B,Postma C,Mongera S,et al.Multiple putative oncogenes at the chromosome 20q amplicon contribute to colorectal adenoma to carcinoma progression[J].Gut,2009,58(1):79-89.

[7] Nour-Eldin HH,Hansen BG,Nørholm MH,et al.Advancing uracil-excision based cloning towards an ideal technique for cloning PCR fragments[J].Nucleic Acids Res,2006,34(18):e122.

[8] CapecchiMR.Altering the genome by homologous recombination[J].Science,1989,244(4910):1288-1292.

[9] KohliM,Rago C,Lengauer C,et al.Facile methods for generating human somatic cell gene knockouts using recombinant adeno-associated viruses[J].Nucleic Acids Res,2004,32(1):e3.

[10] Zhang X,Guo C,Chen Y,et al.Epitope tagging of endogenous proteins for genome-wide ChIP-chip studies[J].Nat Methods,2008,5(2):163-165.

[11] FlierlA,Chen Y,Coskun PE,et a1.Adeno-associated virus-mediated gene transfer of the heart/muscle adenine nucleotide translocator(ANT)in mouse[J].Gene Ther,2005,12(7):570-578.

[12] MillerDG,Wang PR,Petek LM,et al.Gene targeting in vivo by adeno-associated virus vectors[J].NatBiotechnol,2006,24(8):1022-1026.

[13] Hirata RK,RussellDW.Design and packaging of adeno-associated virus gene targeting vectors[J].J Virol,2000,74(10):4612-4620.

Establishment of A Targeting Protein for Xenopus Kinesin-like Protein 2 C'Term inal SBP-3×Flag Tagged HCT 116 Colorectal Cancer CellM odel

HUANG Ze-bin1,ZHANG Ze-yan2,ZHANG Xiao-dong2,M I AO Shi-ying1,WANG Lin-fang1,DU Run-lei2

1NationalLaboratory ofMedicalMolecularBiology,Institute ofBasic Medical Sciences,CAMS and PUMC,Beijing 100005,China2Department of Cellular and DevelopmentalBiology,College ofLife Sciences,Wuhan University,Wuhan 430072,China

DU Run-lei Tel:027-68756606,E-mail:runleidu@whu.edu.cn

ObjectiveTo develop a targeting protein for Xenopus kinesin-like protein 2(TPX2)C'terminal SBP-3×Flag-tagged HCT116 cellmodel.M ethods Homologous armswere amplified by polymerase chain reaction(PCR),and then the adeno-associated virus(AAV)-targeting vector of TPX2 was constructed.HCT 116 cells were targeted after the viruseswere packaged.Positive cell clones with neomycin resistance gene were obtained by G418 and PCR screening.Finally,the neomycin gene cassette was excised after the targeted clones were infected with adenovirus expressing Cre-recombinase,and the TPX2 C'terminal SBP and 3×Flag endogenous double-tagged HCT116 cells were obtained by PCR screening.ResultsTwo positive cell clones with neomycinresistance gene were obtained by PCR screening.The positive cloneswith neomycin resistance gene excised were obtained by Cre adenovirus infection,and the knock-in of SBP-3×Flag gene was verified byWestern blot analysis.ConclusionThe TPX2 C'terminal SBP-3×Flag tagged HCT116 cell modelwas successfully established.

targeting protein for Xenopus kinesin-like protein 2;knock-in;homologous recombination;HCT116;colorectal cancer

Acta Acad M ed Sin,2011,33(6):624-628

杜润蕾 电话:027-68756606,电子邮件:runleidu@whu.edu.cn

R735.3+4

A

1000-503X(2011)06-0624-05

国家重大研究计划项目 (2011CB944302、2011CB944404)、国家重点实验室专项基金 (2060204)和湖北省自然科学基金(2010CDB08704)Supported by the National Basic Research Program of China(2011CB944302,2011CB944404),the State Key Laboratory Special Fund(2060204),and the Hubei Province Natural Science Foundation(2010CDB08704)

2011-10-18)

·论 著·