夜光虫细胞发光光质检测及来源分析

曹 恒 ，韩 晶，刘卫东 ，李桂娟，曹旭鹏

（1.中国科学院大连化学物理研究所海洋生物产品工程组，辽宁 大连116023；2.大连测控技术研究所，辽宁 大连116013；3.辽宁省海洋水产科学研究院，辽宁 大连 116023）

夜光虫细胞发光光质检测及来源分析

曹 恒1，韩 晶2，刘卫东3，李桂娟2，曹旭鹏1

（1.中国科学院大连化学物理研究所海洋生物产品工程组，辽宁 大连116023；2.大连测控技术研究所，辽宁 大连116013；3.辽宁省海洋水产科学研究院，辽宁 大连 116023）

夜光虫（Noctiluca scintillans）是一类生活在海水中的原生动物，同时也是重要的赤潮生物，自20世纪90年代以来，赤潮的光谱遥感预报和监测就得到了关注，但是夜光虫赤潮的光谱遥感准确度尚有不足。这主要是因为目前对夜光虫自身发光光质的认识不足。因此希望在细胞水平上分析确认夜光虫的荧光及其可能成因。在实验室中对夜光虫进行纯培养，检测前改变饲喂方法，已获得具有不同体内食物颗粒的夜光虫。利用倒置荧光显微镜、摄谱仪和时间分辨荧光光谱仪对单细胞水平上夜光虫荧光进行检测。夜光虫具有光激发荧光（红光）和相应刺激后的自发化学荧光（蓝绿光）两类荧光，其中光激发荧光与其吞噬的微藻色素荧光相同。夜光虫发光主要包括以光辐照为基础的光激发荧光和以物理刺激为基础的化学荧光两类，其中光激发荧光来源与夜光虫捕食的藻类，而化学荧光是夜光虫所特有的荧光。夜光虫发光光质的研究，能够为后续的遥感技术发展提供基础生物学信息。

夜光虫；荧光；生物发光；光质；遥感；赤潮

夜光虫（Noctiluca scintillans），又被称为夜光藻，是一类生活在水中的原生动物，在分类上隶属于原生动物门（Protozoa）/甲藻门（Pyrrhophyta）、鞭毛虫纲（Mastigophora）/甲藻纲（Dinofhyceae）、腰鞭毛目（Dinoflagellida）/裸甲藻目（Gymnodiniales），是近岸广泛分布物种。也有人把Noctiluca scintillans称为Noctiluca miliaris Suriray[1]。夜光虫分布极广，除寒带海域外，几乎遍及世界各海区，尤其是河口附近的数量更大，全年均可采集获得[1-2]，同时也是最重要的赤潮生物之一，其赤潮发生频率和范围均相当高[3-4]。作为一种异养生物，夜光虫没有叶绿体，以吞噬其它生物或微小颗粒为生，如浮游植物（如四爿藻[3]）、蓝藻、水蚤的卵、小的鱼卵等[5]。

夜光虫因其在夜间受海水波动刺激能发光得名，当大量夜光虫由于海浪、鱼群或者船舶扰动发光，海面星光万点，似绚丽多彩的礼花，这一现象被称为“海火”。在针对夜光虫发光的科学研究方面，早在1810年，Surirary就报道了在英吉利海峡中夜光虫的发光现象，在1917年Ethel Browne报道除了机械力刺激，电、化学、热、震动的刺激都能引发夜光虫产生荧光[6]。随着显微技术的发展，人们发现，夜光虫受刺激时，细胞质中一种丝状排列的发光颗粒能够发出淡蓝色荧光，其发光持续时间约100 ms[7]。此外，夜光虫含有在紫外光激发下产生蓝绿荧光的颗粒物质[7]。

近年来，随着近岸海水富营养化的加剧，赤潮发生频率和影响范围日益严重，造成巨大的损失。作为主要的赤潮生物之一，夜光虫赤潮的预报一直为人们所关注。目前光谱遥感技术的发展使得通过遥感技术预测和监测赤潮的发生成为可能。光谱遥感技术具有大面积、同步成像和相对廉价的优势。目前遥感监测赤潮主要是依靠对叶绿素及其它附属色素的检测，表现在光谱曲线上即吸收峰位置、反射峰位置和吸收深度不同，已能够成功的识别如丹麦细柱藻、红色中缢虫，但遗憾的是目前光谱遥感技术对夜光虫识别精度不高[8]。

光谱遥感技术对夜光虫识别精度不高的一个可能原因是对夜光虫发光的特征了解不足。尽管对夜光虫发光的研究已经超过100 a，但是已有研究主要集中在夜光虫的发光机制上，关于夜光虫发光光质等的介绍鲜有报道。本文将通过利用荧光显微镜、摄谱仪和荧光光谱仪对夜光虫受激发光光质进行检测，希望能够为光谱遥感预报和检测夜光虫赤潮提供基础生物学信息。

1 材料与方法

1.1 材料

通过浮游生物网在大连周边海域采集水下10 m至表层的夜光虫样本，室温条件下（23～25°C）静置约 1 h，夜光虫浮于表面。用玻璃吸管收集表层的夜光虫，放入经过0.33 μm中空纤维超滤的天然海水中，分两组在16°C进行培养，一组喂食亚心形四爿藻（Tetraselmis subcordiformis），其浓度为4×105cells/mL，每两天投喂一次。对照组不喂食以消耗其自身的食物颗粒。

1.2 仪器

利用连接有数字图像采集系统的尼康Eclipse TE2000U倒置荧光显微镜对夜光虫不同激发波段下的荧光进行观察，所使用的滤镜为 UV-2A（330～380 nm），B-2A（450～490 nm）和 G-2A（510～560 nm）。

摄谱仪可以捕捉设定谱段内的各个波长的发光强度，但是对于夜光虫这种微弱电光源捕捉的灵敏度和准确度不高，因此利用7IGF10定光栅摄谱仪 （北京赛凡光电仪器有限公司）对夜光虫荧光全光谱进行捕捉，确定其发光的主要谱段。

在摄谱仪检测结果的基础上，利用FLS920时间分辨荧光光谱仪（Edinburgh Instruments,UK）的激发光扫描功能对鼓泡情况下夜光虫受激发射荧光进行检测。

1.3 试剂

实验中使用的天然海水为大连10 m深处近岸海水，经沉淀、沙滤后使用0.33 μm中空纤维超滤系统（大连天邦）过滤除菌。

饵料四爿藻为实验室自行培养，使用前通过离心去除培养基。

1.4 操作

1.4.1 荧光图像采集

将10个喂食培养5 d的夜光虫收集到1 mL海水中，平铺在载玻片上，室温条件下分别在可见、紫外、蓝光和绿光4种光源下进行观察，使用显微镜随机附带软件以自动模式进行拍照。同时以不喂食四爿藻的夜光虫作为对照。

1.4.2 物理刺激下夜光虫发光光质测定

因为夜光虫在水流、气泡的影响下会产生蓝绿光，因此这里对气泡影响下的夜光虫发光进行检测。

在450～550 nm范围内利用摄谱仪进行光质检测，获得夜光虫自身受激发光的初步信息。将约30个夜光虫收集到2 mL天然海水中，放入1 cm比色杯。将摄谱仪光纤探头固定于比色杯口处，同时将输液器针头插入液面下方。用铝箔纸将比色杯、针头与探头包裹形成避光环境。室温条件下，向比色杯内鼓空气刺激荧光产生，通气速率量约20 mL/min。摄谱仪曝光时间10 s。

将约30个夜光虫放入1 cm比色杯中，将注射器针头插入液面下并通过输液管引出荧光光谱仪，手动进行鼓泡，通气速率量约20 mL/min空气。荧光仪以5 nm/s的速度在450～550 nm范围内对夜光虫荧光进行扫描检测。

获得的光质数据导入OriginPro（version 8.1 SR3,Origin-Lab Corporation）进行分析、作图。

2 结果与分析

2.1 荧光图像分析

图1 夜光虫和其内部吞噬的微藻

保持喂食的夜光虫在可见光下能清楚的看到细胞内部具有大量的食物，其中四爿藻的形态可以辨识（图1）。

图2 不同激发光条件下夜光虫荧光

在不同激发光波长条件下，夜光虫及其内部的四爿藻呈现出不同的荧光。由于夜光虫自身运动影响，可见光与荧光图中相对位置略有差异，但是不难看出，在不同激发光条件下，夜光虫表面粘附及被吞噬在夜光虫内部的四爿藻均呈现出红色（图2）。相比之下，对照组的夜光虫内部只有少量红色荧光（图3）。

夜光虫细胞质只有在紫外条件下有明显的蓝色荧光（图2、图3）。荧光来源于夜光虫内部的颗粒状物质，与文献中报道[7]一致。

2.2 光质检测结果

摄谱仪同时检测整个待测波长范围，可能因为并不适用于微弱电光源的检测，检测结果信噪比低，但是能够看出在498 nm附近有最强的夜光虫发光产生（图4左上）。荧光光谱仪的检测灵敏度高，在501 nm处有最高吸收，信噪高。但是荧光光谱仪属于扫描型检测，检测波长可能与夜光虫发光不同步，因此所获得的检测峰对称性稍有欠缺（图4）。结合这两种检测的结果，夜光虫在物理刺激下发出的荧光应该在500 nm±5 nm。

3 讨论

作为一种异养生物，正常状态下夜光虫自身细胞质内没有色素或者色素很少，呈透明状。但是当夜光虫生长到一定的种群密度或者由于其它原因使其聚集则逐渐变为粉红色，形成赤潮。因此，夜光虫在赤潮形成之前，自身的颜色可能难以被用来进行光谱遥感预报。但是夜光虫的两个特点为我们进行相应检测提供了可能。一种是夜光虫由于吞噬食物颗粒的色素而具有颜色，另一种是夜光虫自身受刺激后发光。

图3 对照组未喂食夜光虫紫外下的荧光照片

从本实验中可以看出，由于夜光虫大量进食四爿藻，未彻底消化的四爿藻体内的叶绿素等色素在紫外、蓝、绿光激发下均呈现出红色荧光，并且强度很高。从实际采样过程中，也发现部分夜光虫体内具有微藻等含有色素的食物颗粒，由于已有的光谱遥感工作中[8]，通常使用叶绿素荧光作为检测谱段，因此在自然条件下这将导致难以区分夜光虫为主的赤潮和夜光虫饵料藻引发的赤潮。实验中发现，夜光虫自身受紫外激发会产生明亮的蓝色荧光。这部分荧光应该具有很好的夜光虫种属特异性。在参考文献[8]中也介绍400～585 nm段，光谱遥感数据对夜光虫有较好的识别能力，只是结合了叶绿素荧光谱段后，发生错误的识别。

图4 夜光虫物理刺激下荧光光谱

因此，在基于日光的光谱检测（激发、吸收、反射灯）之外，寻找夜光虫特征性的检测指标对于提高遥感识别夜光虫具有重要的应用价值。本实验通过利用摄谱仪和荧光光谱仪对夜光虫自身作为应激反应的发光光质进行了检测，发现夜光虫自身受激发光为500 nm附近的蓝绿光，不需要额外光源。仅管在实验中观察发现，无论白天黑夜夜光虫都有荧光的产生，但是在白天受日光的影响，这部分荧光太过微弱难以有效的从背景中分离并进一步应用，在夜晚，由于外界光源减弱，有可能通过遥感技术对此进行检测，并用以和其它光谱遥感数据相结合，作为预测和监测夜光虫赤潮的一个指标，应该能够提高光谱遥感检测的准确性。

[1]杞桑，江天久.中国沿海的夜光虫和夜光虫赤潮概述[J].中山大学学报论丛，1995（3）：244-245.

[2]张天文，朱丽岩，徐培培，等.胶州湾夜光虫丰度的季节变化和分布特征[J].中国海洋大学学报(自然科学版),2009，39(S1)：89-93.

[3] 吴玉霖，周成旭，张永山.夜光藻的室内培养[J].海洋与湖沼，1994，25（2）：165-167.

[4] 周成旭，吴玉霖，邹景忠.夜光藻的营养动力学[J].海洋与湖沼，1994，25（2）：152-157.

[5]Balch W M，Haxo F T.Spectral properties of Noctiluca miliaris Suriray,a heterotrophic dinoflagellate [J].Journal of Plankton Research,1984,6(3)：515-525.

[6]Eckert R.Bioelectric control of bioluminescence in the dinoflagellate Noctiluca[J].Science,1965,147：1140-1145.

[7]Eckert R， Reynolds G T.The subcellular origin of Bioluminescence in Noctiluca miliaris [J].The journal of General Physiology,1967,50(5)：1429-1457.

[8]马毅.赤潮航空高光谱遥感探测技术研究[D].青岛：中国科学院海洋研究所，2003.

Detection and Characterization of Bioluminescence of Noctiluca Scintillans

CAO Heng1,HAN Jing2,LIU Wei-dong3,LI Gui-juan2,CAO Xu-peng1
(1.Dalian Institute of Chemical Physics,Chinese Academy of Sciences,Dalian Liaoning 116023,China;2.Dalian Scientific Test&Control Technology Institute,Dalian Liaoning 116013,China;3.Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute,The Key Laboratory of Marine Fishery Molecular Biology of Liaoning Province,Dalian Liaoning 116023,China)

Noctiluca scintillans is widely distributed throughout the world,occurring most often in coastal waters.N.scintillans is also a major source of red tide.Since 1990s,the forecast and monitoring of red tide by way of remote sensing has drawn more attention,but there is still problem in the precision of identifying N.scintillans.It is necessary to analyze the bioluminescence cause from the cell level.The method of cultivating N.scintillans in the lab to detect using fluorescence microscope,spectrograph meter and fluorescence spectrometer is adopted.There are two type of bioluminescence of N.scintillans,sunlight induced fluorescence derived from the preyed alga and chemi-luminescence induced by mechanical stimulation.It’s hoped to contribute some basic biology information for the further development of N.scintillans dominant red tide by remote sensing.

Noctiluca scintillans;fluorescence;bioluminescence;spectrum;remote-sensing;red-tide

Q89

A

1003-2029（2011）03-0009-04

2011-05-04

水下测控技术国防科技重点实验室基金项目资助（9140C2603110905）

曹旭鹏(1978-)，男，副研究员，生物化工博士，研究主要包括海洋微藻资源利用，海洋微生物资源利用和生物酶催化。Email:c_x_p@dicp.ac.cn