五种金属离子对 S5产表面活性剂性能的影响

刘 超,李小慧,李 静

生物表面活性剂 (Biosurfactants)是表面活性剂家族中的后起之秀,它是由微生物所产生的一类具有表面活性的生物大分子物质。与化学合成的表面活性剂相比,生物表面活性剂除具有降低表面张力、稳定乳化液和增加泡沫等相同作用外,还具有一般化学合成表面活性剂所不具备的无毒、易生物降解等优点,愈来愈受到人们的青睐[1]。目前生产成本过高是生物表面活性剂走向市场的主要障碍,所以优化培养基、提高生物表面活性剂产量、降低生产成本是其能否进行工业化生产的关键。

目前有关提高微生物表面活性剂产量的研究比较多,归纳起来主要有以下几方面:(1)产优良表面活性剂菌株的筛选。自然界存在很多产表面活性物质的微生物 ,筛选出优良的产表面活性剂菌株是提高微生物表面活性剂产量的基础。其中比较典型的菌种包括了产鼠李糖脂 (rhamnolipid)的假单胞菌属 (Pseudom onass p.),产表面活性素 (surfactin)的枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis),产槐糖脂(Sophor oli pids)的球拟酵母 (Torulopsis bombicola),产海藻糖脂的红球菌属 (Rhodococcus erythropolis)等。目前已有很多关于筛选生物表面活性剂生产菌株的报道[2-4]。(2)碳源、氮源的优化。碳源是影响微生物表面活性剂产量的一个非常重要的因素,选择合适的碳源,可以大大提高微生物表面活性剂的产量。甘油、甘露醇、葡萄糖、原油等均可作为某些产表面活性剂菌株的碳源[5-7]。(3)利用诱变、基因工程等科技手段构建超级细菌以提高微生物表面活性剂产量[9-10]。

微量元素是微生物生长必不可少的条件,其中的某些金属离子以辅基或辅酶的形式参与微生物体某些酶系的合成,对微生物体的新陈代谢起着重要的调节作用。目前关于金属离子对微生物表面活性剂生产调节的研究报道还比较少,本文研究了五种金属离子对 S5菌产表面活性剂性能的影响。

1 试验部分

1.1 菌种和仪器

菌种来源:S5、Y2、Y8菌株来自实验室分离保存的菌株,4℃保存于牛肉膏蛋白胨斜面上,并定期转接。

仪器:pH计、高压灭菌锅、离心机、恒温培养箱、分光光度计、表面张力仪(自制)。

1.2 优化发酵培养条件的摇瓶试验

种子培养基配方及培养方法:牛肉膏 3.0 g,蛋白胨 10.0 g,NaCl 5.0 g,pH为 7.2～7.4,121℃高压蒸汽灭菌 30 min。在种子培养基中接种 S5菌,培养条件为:温度 30℃,转速 180 r/min,时间 30 h。

产表面活性剂发酵培养基及培养方法:无机盐培养基 1:(1)磷酸盐缓冲液:K2HPO4·H2O 21.75 g, Na2HPO4·12H2O 33.4 g,KH2PO48.7 g,NH4Cl 5.0 g,溶于 1 000 mL蒸馏水中。(2)硫酸镁溶液: MgSO422.4 g溶于 1 000 mL蒸馏水中。(3)氯化铁溶液:FeCl30.25 g溶于 1 000 mL蒸馏水中。(4)微量元素。(5)氯化钙溶液:CaCl236.4 g溶于1 000 mL蒸馏水中。依次加入上述硫酸镁溶液3.0 mL,微量元素溶液 1.0 mL,氯化铁溶液 1.0 mL,氯化钙溶液 1.0 mL,磷酸盐缓冲溶液 5.0 mL,调节pH为 9,用蒸馏水定容至 1 000 mL。经高压蒸汽灭菌备用。

无机盐培养基 2:(1)磷酸盐缓冲液:K2HPO462 g,NaH2PO433 g,调节 pH为 7.5,溶于 1 000 mL蒸馏水中。(2)硫酸镁溶液:MgSO4·7H2O 24.64 g溶于 1 000 mL蒸馏水中。(3)氯化钙溶液: CaCl2·2H2O 14.72 g溶于 1 000 mL蒸馏水中。(4)微量元素。依次加入上述硫酸镁溶液 0.5 mL,氯化钙溶液 0.1 mL,微量元素 1 mL,磷酸盐缓冲液25 mL,NH4NO31.004 g,溶于 1 000 mL蒸馏水中,经高压蒸汽灭菌备用。

培养方法:碳源用量:固体 20 g/L;液体:5% (以葡萄糖为碳源时,采用低压灭菌;以淀粉为碳源时,先用少许无机盐将淀粉调成糊状,并将其加入微沸的无机盐中,搅拌使其溶解)。温度30℃,摇床转速:180 r/min;发酵时间 80 h;做有关金属离子对 S5产表面活性剂影响的实验时,用电阻率为15 MΩ·m的纯水配制。

1.3 表面张力、排油圈及微生物表面活性剂的提取

表面张力的测定:使用最大气泡法仪器进行测量。

排油圈测定方法:加蒸馏水 15 mL于直径为9 cm的培养皿中,并在水面中心处缓慢加 0.5 mL橄榄油,待油膜均匀平铺在培养皿表面时,在油膜中心加 0.1 mL离心后的摇瓶发酵液,中心油膜被挤向四周形成一个圆圈,圆圈直径与表面活性剂的含量和活性成正比,测量直径大小。

表面活性剂提取方法:取出摇瓶发酵液, 10 000 r/m in离心 10 m in除菌体;取其上清液用6 mol/L HCl调 pH至 2.0,将上清液置于 125 mL的分液漏斗,用 CH2Cl2等体积萃取两次,分层后收集下层液体,冷却干燥得到生物表面活性剂的粗品。

1.4 水体石油的微生物降解试验

石油烃降解培养基:将一定量的无机盐 2培养基于 121℃灭菌 30 min,接种前加入一定量石油醚溶液使体系油浓度为 1 g/L。

降解体系石油含量测定方法:重量法[11]。

2 结果与讨论

2.1 S5菌在无机盐 1和无机盐 2中生长状况的对比(表1)

表1 S5在不同碳源上的生长情况

本实验室有两组可供大部分细菌良好生长的无机盐配方,选取 4种不同的碳源,分别用无机盐 1和无机盐 2配成发酵体系,测试在不同无机盐和碳源上 S5的生长状况和表面活性剂生产情况以筛选出适合 S5产表面活性剂的无机盐配方和碳源。由表1可以看出:在不同的碳源上 S5菌的生长状况差异非常明显。以淀粉和乙二醇为碳源时,在无机盐 1和无机盐 2上的 OD值依次为:0.116、0.109、0.091、0.056,说明 S5菌几乎不能利用这两种碳源。以葡萄糖和甘油为碳源时,在无机盐 1和 2中 S5菌生长良好,OD值依次达到 1.285、2.301、1.593和 0.503 (稀释 10倍后),并且也产生了表面活性剂,发酵液表面张力均下降到了 31 mN/m左右。在无机盐 2中以甘油为碳源时表面活性剂产量达最高值6.37 g/L,说明甘油可作为 S5菌生产表面活性剂的最佳碳源。由表1还可以看出,无论是以葡萄糖还是以甘油为碳源时,无机盐 2中表面活性剂产量均高于无机盐 1中的产量,说明无机盐 2更适合作为S5菌产表面活性剂的培养基。

2.2 金属离子对 S5产表面活性剂的影响

由以上试验可知,无机盐 2比无机盐 1更适合作为 S5产表面活性剂的培养基。仔细对比两组无机盐配方可知,无机盐 2的微量元素较无机盐 1丰富,可能是某些金属离子是控制 S5产表面活性剂的酶所必需的,其含量的增加大大增强了 S5产表面活性剂的能力,使得无机盐 2中表面活性剂的产量高于无机盐 1。本试验旨在验证无机盐 2中的五种金属离子对 S5产表面活性剂性能的影响,试验结果如图1～3所示。

通过对比以上 6组不同的发酵体系,五种金属离子均对 S5的生长起到一定的作用。缺少五种金属离子中的任何一种,都会使发酵体系的OD值、pH及表面活性剂产量较对照组有显著下降。因此上述五种金属离子对 S5产表面活性剂起到了明显的促进作用。

图1 金属离子对发酵液pH的影响

图2 金属离子对发酵液OD的影响

图3 金属离子对表面活性剂产量的影响

2.3 多因素正交优化试验

以上试验表明,五种金属离子对 S5产表面活性剂均有一定的影响,为了确定各金属离子的最佳浓度,本试验采用五因素四水平对上述无机盐 2中五种金属离子的浓度进行优化。正交试验设计如表2所示。

表2 正交试验设计

按照表2配制 16组发酵培养基 ,条件均与无机盐 2保持相同。在培养基上接种 S5菌并进行微生物表面活性剂的发酵生产 ,发酵时间为 80 h。正交优化试验结果如表3所示。

表3 正交优化试验结果

从表3可以看出 ,15号培养基的表面活性剂产量最高。对试验结果进行直观分析 ,其中k1～k4分别为每一列因素中第 1～4种水平所对应的表面活性剂产量的总和。比较每一种因素中各个水平所对应的 k值 ,可得出各因素的最优组合水平为 A3B3C2D4E3。即发酵体系中 Co2+、B3+、Fe2+、Cu2+、Ni2+的浓度依次为 0.022、0.022、0.906、0.018、0.012 mg/L时表面活性剂产量达到最高。根据极差分析,各因素对产表面活性剂影响大小顺序依次为:Fe2+>Co2+>B3+>Cu2+>Ni2+。因该方案不在已做的 16组试验中 ,因此 ,补充以 A3B3C2D4E3为培养基的表面活性剂生产试验。试验结果为:表面张力31.23 mN/m,pH=6.83,表面活性剂产量为12.73 g/L,比 15号培养基的要高。

2.4 S5产表面活性剂对水体中微生物降解石油烃的促进作用

烃类的憎水性结构 ,是其难以生物降解的主要原因 ,而生物表面活性剂可以增加憎水性有机化合物与水之间的接触面 ,提高憎水性有机化合物的水溶性 ,从而促进微生物对它的吸收和降解。本试验探究了 S5产表面活性剂对两株石油烃降解菌 Y2、Y8降解石油烃的促进作用。

Y2和 Y8降解石油烃过程中,以加入微生物表面活性剂的和不加活性剂的作对照试验,加入活性剂的一组在降解一开始就可观察到石油被乳化在水体中,整个降解体系呈均匀的墨黑色,随着时间的推移颜色逐渐变浅,到第 5天,降解体系呈深棕色。没有加入表面活性剂的降解体系,在降解第 1天石油漂浮在水体表面,油水分解明显,并有大量石油黏附在三角瓶壁,降解第 2天仍有大量石油漂浮于水体表面,但有一部分石油以小絮体的形式悬浮在水体中,第 3天到第 5天悬浮在水体中的石油絮体颗粒进一步增加,并且絮体颗粒逐渐变小,试验结果如图4、5所示。

图4 Y8在不同表面活性剂浓度下降解水体中石油烃

图5 Y2在不同表面活性剂浓度下降解水体中石油烃

由图4可知,与对照相比微生物表面活性剂的加入确实促进了 Y8对石油烃的降解。加入表面活性剂的体系石油降解速率明显快于对照组,尤其是在前三天效果尤为显著。在第 3天时,表面活性剂含量为 300 mg/L和 50 mg/L的降解体系中石油含量分别降低到 0.53 g/L和 0.65 g/L,较空白体系0.85 g/L降低了许多。在第 3天以后表面活性剂的促进作用有所减弱,可能是由于在微生物的作用下,表面活性剂被分解,促进作用减弱。

由图5可知,微生物表面活性剂对 Y2降解水体中石油烃也同样起到了一定的促进作用,与 Y8的降解趋势相似,也是在降解的前期促进作用明显,在降解后期促进作用有所减弱。

3 结论

(1)S5菌产表面活性剂的最佳碳源为甘油,最佳无机盐培养基组成为无机盐 2。并且无机盐 2中五种金属离子 Co2+、B3+、Fe2+、Cu2+、Ni2+的含量对S5菌产表面活性剂的性能有显著影响,发酵液中五种金属离子的最佳浓度依次为:0.022、0.022、0.906、0.018、0.012 mg/L。

(2)S5菌产生的表面活性剂能够增加石油在水中的溶解度,对石油降解菌 Y2、Y8降解水体中石油烃有明显的促进作用。

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