棉花DEELA基因干扰载体的构建及转化研究

袁英歌，郭传宇，高朝宝，张定国，彭明，崔百明

棉花DEELA基因干扰载体的构建及转化研究

袁英歌，郭传宇，高朝宝，张定国，彭明，崔百明

（石河子大学农学生物技术重点实验室／石河子大学生命科学学院，石河子832003）

本研究联合了棉花DELLA蛋白基因Gh GAI 1和Gh GAI 2的部分序列构建了在棉花纤维细胞中优势表达hp RNA的表达载体。通过农杆菌介导法转化新疆主栽棉花品种新陆早33号，在其不同生长期对其不同组织部位进行大田转化，主要侵染方法有茎尖浸润法、花苞注射法和花喷洒法，以研究不同方法的转化效率。对T1代植株进行卡那霉素筛选及PCR检测，结果表明这3种侵染方法均获得了抗卡那霉素的转化植株，而只在通过花喷洒法和花苞注射法获得的抗性植株中检测到目的基因。

棉花；干扰载体；农杆菌介导转化；转基因植株

赤霉素（Gibberellin，GA）是一种高效的植物激素，能够促进完整植株的伸长、生长，对棉纤维的分化和发育起促进作用［1－2］。DELLA 蛋白为 GA 信号传导途径中一类重要的蛋白作用因子，负调节植物体中 GA 信号水平［3］。2009年，王栓锁等［4］利用农杆菌介导法将构建的棉花DELLA基因过量表达载体导入拟南芥中，进一步证明了DELLA蛋白参与GA信号通路。

自1987年Umbeck等［5］首次报道了利用农杆菌介导法成功将npt II基因和CAT基因导入陆地棉品种珂字312、310中以来，该转化方法在棉花遗传育种中得到了广泛应用［6－10］。1990年Perlak等将Bt基因导入棉花，得到了抗虫棉花，经过连续4年的室内测定表明：转基因棉花抗鳞翅目幼虫，抗性稳定，并可以通过种子遗传［7］。陈志贤等［11］利用农杆菌介导法将Bt抗虫基因导入晋棉7号，获得了转基因抗虫棉植株，通过进一步的选择，培育出晋棉26号 （GK95-l）转基因抗虫棉品种。Leelavathi等［12］报道了农杆菌转化珂字310胚性愈伤获得转基因棉花。

目前，用于棉花遗传转化的方法主要有农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法和PEG介导法。与其他转化方法相比，农杆菌介导法具有转化机理比较清楚，转化方法成熟，转化效率相对较高，目的基因表达部位可以控制以及转化的目的基因在植物基因组中多为单拷贝、易于双子叶植物的遗传转化、以及遗传稳定性好等优点。但采用农杆菌介导法进行棉花遗传转化时，通常都需要经过组织培养和植株再生的方法获得转基因植株，而此过程受到基因型的限制，到目前为止只有少数棉花品种可以直接得到转基因的再生植株，而其他的棉花品种往往需要通过杂交、嫁接等传统育种方法获得生产所需的特性，从而在一定程度上阻碍了棉花遗传转化的发展。

本研究以棉花品种新陆早33号为材料，在大田中随机选取一定数量的棉花植株进行农杆菌介导转化，通过对棉花茎尖、花苞和未受精花进行转化，研究大田中农杆菌介导法的转化效率，以期寻找出最佳的转化时间和转化部位，使棉花的遗传改良突破基因型的限制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料

供转化的材料为新疆主栽棉花品种新陆早33号。在石河子大学棉花所试验田中任选一定数量的材料作为实验对象，获得的T0代种子于同年冬季在海南进行卡那霉素筛选。

1.1.2 菌株及质粒载体

根据已知的生物学信息，由上海生物工程有限公司合成棉花2个DELLA基因GAI 1和GAI 2，及其基因组中的某一内含子，将其连接到PUC57载体上，得 到 的 新 载 体 命 名 为 PUC56-H W1-2。p BI121和PCA MBIA-2300等载体，大肠杆菌（E.coli）DH5α和根瘤农杆菌（Agrobacterium tumef aciens）GV3101等均为本实验室保存和构建。

1.1.3 培养基

本实验所用培养基为LB培养基和1／2 MS培养基，由本实验室制备。

1.1.4 试剂

各种限制性内切酶和实验中所用的生化试剂均购自上海生物工程技术有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 干扰载体的构建及策略

本研究拟构建含有2个棉花DELLA基因的干扰载体（图1），具体构建策略见图2。引物RDL1为棉花中组织特异性表达启动子。

图1 DELLA基因干扰载体模式图Fig.1 The diagram of interference vector of DELLA gene

图2 干扰载体构建策略Fig.2 Strategy of construction of interference vector

1.2.2 侵染液的制备

挑取根瘤农杆菌单菌落于50 mL加有抗生素：卡那霉素（50 mg／L）、庆大霉素（40 mg／L）和利福平（25 mg／L）的 LB培养基中，28℃，300 r／min震荡培养至OD600值为2.0～2.5，4℃，10000 r／min离心5 min，收集菌体，重悬于蔗糖0.4%，乙酰丁香酮50 mg／L，sil wet-77 0.02%的1／2 MS侵染液中，室温，300 r／min震荡培养至OD600值达到0.5～0.6，备用。

1.2.3 转化方法

本实验主要采用3种侵染方法：1）茎尖浸润法。对生长45 d左右的棉花植株进行农杆菌介导的茎尖浸润侵染，用20 mL的医用针管吸取侵染液，缓慢的滴加到棉花茎尖部位，使侵染液将茎尖完全浸润，隔3 d按同样方法再侵染1次；2）花苞注射法。在开花前3－5 d进行注射，选取每个果枝的第1和第2个果节的花朵进行侵染，一般此类花朵的成铃率较高，从而避免了因外界因素引起的转化效率降低；3）花喷洒法。开花当天，选择每个果枝的第1和第2个果节上未受精的花（白色花）进行侵染。对花的正面喷洒，使整个花面湿润，喷洒2～3次即可。

由于3种侵染方法与棉花的生长时期有关，且侵染部位不同，所以其转化数量有所不同（表1）。

表1 各种侵染方法的侵染量Tab.1 The quantity of infection of different methods

1.2.4 卡那霉素筛选

将获得的T0代种子于同年冬季在海南进行南繁，在大田中用卡那霉素对T0代植株进行筛选，具体操作如下：从种子萌发出苗到子叶平展或第1片真叶时进行卡那霉素筛选，所用卡那霉素的浓度为2000～4000 mg／L，将溶液均匀的喷洒到叶片表面，主要是叶片下表面，使叶片能够充分的吸收卡那霉素溶液，处理后4－5 d开始观察叶片对卡那霉素的反应情况。

1.2.5 DNA提取方法

采用CTAB法提取DNA。用2 mL离心管管盖夹取1个新鲜叶片，加入钢珠及液氮快速震荡，使叶片完全破碎，快速加入含有1%β－巯基乙醇的2%CTAB buffer，65℃保温30 min，然后加等体积的氯仿，充分混匀，常温条件下，12000 r／min，离心10 min，取上清，加入2／3 V的异丙醇缓慢颠倒数次，12000 r／min，离心10 min，弃上清，加入1 mL的70%乙醇进行洗涤，12000 r／min，5 min，弃上清，吹干，加入100μL无菌水溶解，备用。

1.2.6 PCR检测

以棉花总DNA为模板，分别以DT.Ri12和DT.Ri34为引物进行PCR扩增，其中DT.Ri12是以目的基因R12所设计的单引物，序列为5′-CAC AGC TTG GTG ATA CTG TTC A-3′；DT.Ri34是以目的基因R34所设计的单引物，序列为5′-AAC GGT GGT TCT GCT TAT GAG A-3′。扩 增 采 用 TDPCR，扩增程序：94℃变性5 min，94℃变性30 s，60℃／63℃退火30 s，72℃延伸30 s，每一循环降1℃，10 cycle，94℃变性30 s，50℃／53℃退火30 s，72℃延伸30 s，20 cycle，最后72℃延伸7 min，4℃保存。1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。

2 结果与分析

2.1 卡那霉素检测结果

一般在喷洒卡那霉素后4－5 d就可明显识别出植株是否具有抗性，7 d即可确定检测结果。对卡那霉素无抗性的植株子叶表面会出现黄斑，随后变为黄白色斑块，最终整个叶片枯死脱落；而抗卡那霉素的植株子叶叶片上没有任何斑点，叶色正常，因此，其很可能为转基因植物。

对获得的T0代植株进行卡那霉素抗性的检测结果表明：共得到37株抗卡那霉素植株，且3种侵染方法均可得到抗性植株，其中以花喷洒法的抗性植株数量最多，为18株；其次是花苞注射法，得到17株；茎尖浸润法所获得的抗性植株最少，仅为2株。

2.2 PCR检测结果

提取抗卡那霉素植株叶片总DNA进行PCR检测，以转化的目的基因所设计的单引物进行PCR。图3为部分抗性植株的PCR检测结果。

由图3可知：尽管卡那霉素检测出的是抗性植株，但仍有部分抗性植株中检测不到目的基因，也就是说卡那霉素检测为抗性的植株并非是转基因植株或是目的基因并没有整合到棉花基因组上，即为非转基因植株。

对抗卡那霉素植株的检测结果（图3）表明：共有27株抗性植株中检测出目的基因。其中茎尖浸润法虽然获得了抗卡那霉素植株，但在这些抗性植株中并未检测出目的基因，而从采用花喷洒法进行侵染获得的抗性植株中检测出目的基因的植株比例最高达到99%，花苞注射法次之，为90%。

图3 抗性植株的PCR检测Fig.3 PCR identification for kanamycin-resistant plants

3 讨论

农杆菌介导棉花遗传转化，大多是通过组织培养的方法获得转基因植株，因此转化过程中受到很多因素的制约：棉花基因型是限制植株再生一个关键性因素［13］，到目前为止，实现植株再生的多为珂字棉或者有珂字棉遗传背景的品种［14－15］；棉花转化外植体的选择，多以下胚轴作为外植体，而在大田中进行农杆菌介导的棉花遗传转化无需经历组织培养及植株再生的过程，且当年即可获得转基因植株。

大田中采用农杆菌介导法进行转化具有以下优点：1）此过程不依赖于植物组织培养及植株再生。通过该转化方法可以直接获得转基因的种子，从而可以实现因基因型限制而无法直接得到转化植株的棉花品种的遗传转化；2）农杆菌介导法本身具有转化机理比较清楚，目的基因表达部位可以控制，目的基因多为单拷贝存在以及遗传稳定性好等优点，这使得所得到的转基因植株更具有生产意义；3）转化时间短，棉花的生长周期为6个月，当年就可得到转基因植株；4）转化方法简便，工作量小，易于普通研究工作者熟练掌握，适宜进行大田棉花的大规模转化。同时该转化方法也有自身的缺点：1）受环境条件的影响大；2）受棉农开花时期的制约。

在对转化植株的筛选和鉴定方面，由于本实验采用的标记基因为nptⅡ基因，可以在转化苗初期进行卡那霉素抗性筛选。用喷壶将卡那霉素溶液均匀的喷洒到叶片的表面，主要是子叶的下表面，这有利于叶片能够更好的吸收卡那霉素，使初筛更有效。然后对抗性植株做进一步的PCR检测，结果表明：部分的抗卡那霉素植株中并未检测出目的基因，即为假阳性转基因植株。分析其原因有：1）苗期植株的整齐度对筛选效果的影响，过小的植株叶片由于无法充分接触到卡那霉素而叶色正常；2）转化过程中目的基因丢失出现假阳性的转化植株；3）环境对卡那霉素筛选效果的影响，一般在晴天进行筛选的效果更好，而高温、干燥和高强度光照时效果更优。

本研究用农杆菌介导法对大田棉花进行了遗传转化。3种侵染方法均获得了抗卡那霉素的植株，花喷洒法获得的转化植株最多，其次是花苞注射法，而茎尖转化法未获得目的基因PCR检测阳性植株。茎尖转化法难以获得转基因植株说明用简单的渗透方式可能很难使农杆菌到达茎尖分生组织部位。基于花器官的转化法（真空渗透法［16］、蘸花法［17］和喷花法）因其简单并具有稳定的转化率而在拟南芥上被广泛采用，然而这种方法在推广到其它植物时，其转化效率可能受到花器官结构的影响，而未必能获得理想的结果。例如，拟南芥Ler生态型的转化效率就比拟南芥Col生态型的代［17］；影响花结构的突变化也影响转化率［18］。棉花本身种子大、种子最较小，并不适合用作花器官的转化，但在棉花转化方法尚未成熟之前，这种易于掌握的转化方法还是值得去探索的。

［1］杜雄明，陈金桂，张天真.5个棉花纤维突变体胚珠内源激素差异及对纤维分化和前期生长的影响［J］.棉花学报，1998，10（1）：43-51.

［2］刘康，孙敬，张天真.内源及外源激素对陆地棉无絮突变体胚珠纤维初始发育诱导效应的研究［J］.棉花学报，1999，11（1）：48-56.

［3］Olszewski N，Sun T P，Gubler F.Gibberellin signaling：biosynthesis，catabolis m，and response pat hways［J］.The Plant Cell，2002，14：61-80.

［4］王栓锁，曲廷云，薛金教，等.棉花Gh GAI 1基因克隆及其功能的初步分析［J］.石河子大学学报：自然科学版，2009，27（5）：548-553.

［5］Umbekeck P.Genetically cotton （Gossypiu m hirsutu m L）plants［J］.Biotechnology，1987，5：263-266.

［6］Zapata C，Park S H，El-Zik K M，et al.Transfor mation of a texas cotton cultivar by using Agrobacterium and the shoot apex［J］.Theor Appl Genet，1999，98：252-256.

［7］刘传亮，武芝霞，张朝军，等.农杆菌介导棉花大规模高效转化体系的研究［J］.西北植物学报，2004，24（5）：768-775.

［8］Shuangxia Jin，Xianlong Zhang，Shaoguang Liang，et al.Factors affecting transfor mation effciency of embr yogenic callus of Upland cotton （Gossypium hirsutum）with Agrobacteriu m tu mef aciens［J］.Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2005，81：229-237.

［9］Ganesan Sunilkumar，Keerti S Rathore.Transgenic cotton：factors inffuencing Agrobacterium-mediated transfor mation and regeneration［J］Molecular Breeding，2001，8：37-52.

［10］王伟，朱祯，高越峰，等.双价抗虫基因陆地棉转化植株的获得［J］.植物学报，1999，41（4）：384-388.

［11］陈志贤，李淑君.棉花细胞悬浮培养胚胎发生和植株再生某些特性的研究［J］.中国农业科学，1987，20（5）：6-11.

［12］Leelavathi S，Sunnichan V G，Kumria R，et al.A si mple and rapid Agrobacterium-mediated transfor mation protocol for cotton（Gossypium hirsutum L.）：embryogenic calli as a source to generate large numbers of transgenic plants［J］.Plant Cell Rep，2004，22：465-470.

［13］Tr olinder N L，Chen X.Genotype specificity of the somatic embryogenesis response in cotton［J］.Plant Cell Rep，1989，8：133-136.

［14］Shoemaker R C，Couche L J，Galbraith D W.Characterization of so matic embr yogenesis and plant regeneration in cotton （Gossypiu m hirsutu m L.）［J］.Plant Cell Rep，1986，5：178-181.

［15］Saeed R，Hafeez R.A study of in vitro regeneration in relation to doses of growth regulators in hybrids of upland cotton［J］.Plant Cell Tissue Organ Cult，2005，83：209-215.

［16］Bechtold N，Pelletier G.In planta Agrobacteriu m-mediated transf or mation of adult Arabidopsis thaliana plants by vacuu m infiltration［J］.Met hods Mol Biol，1998，82：259-266.

［17］Clough S J，Bent A F.Floral dip：a si mplified method for Agrobacteriu m-mediated transf or mation of Arabidopsis t haliana［J］.Plant J，1998，16：735-743.

［18］Desfeux C，Clough S J，Bent A F.Female reproductive tissues are the pri mar y tar get of Agr obacteriu m-mediated transfor mation by the Arabidopsis floral-dip method.Plant Physiol，2000，123：895-904.

Construction of Interference Vector and Genetic Transfor mation for DELLA Gene of Cotton

YUAN Yingge，GUO Chuanyu，GAO Chaobao，ZHANG Dingguo，PENG Ming，CUI Bai ming1
（Key Laboratory of Agricultural Biotechnology／College of Life Sciences，Shihezi University，Shihezi 832003，China）

In this study，hp RNA vector was constructed by ligating the some fragments of the GhGAI1 and GhGAI2 of DELLA protein genes.Then we infected Xinluzao 33（G.hirsutum －the main cultured cotton variety in Xinjiang）by the method of Agrobacterium-mediated transfor mation in different growth periods and at different growth sites.To find the best transfor mational tissues and best transfor mational periods，three methods were used：infiltration of cotton shoot apex，injection calyx and floral spray.Transgenic plants were screened by Kanamycin and poly merase chain reaction（PCR）.The result indicates that the floral spray and injection of calys method can achieve transgenic plants，while infiltration of shoot apex method can not.

cotton；interference vector；Agrobacterium-mediated transfor mation；transgenic plants

S511.01；Q789

A

1007-7383（2011）04-0397-04

2011-01-29

国家转基因重大专项（2008ZX08005-002），新疆兵团博士资金项目（2007JC08）

袁英歌（1982-），女，硕士生，专业方向为植物基因工程；e-mail：gezi614.811＠163.co m。

崔百明（1970-），男，副教授，博士，从事植物基因工程研究；e-mail：bai mingc＠shzu.edu.cn。