嗜麦芽窄食单胞菌生物被膜形成的体外抗菌活性研究*

梁歌宏 宋诗铎 孙二琳 王 哲 祁 伟

嗜麦芽窄食单胞菌生物被膜形成的体外抗菌活性研究*

梁歌宏 宋诗铎 孙二琳 王 哲 祁 伟△

目的：研究天津地区嗜麦芽窄食单胞菌（SMA）感染与耐药现状，观察临床常用抗生素对其形成生物被膜后的作用效果。方法：分析临床分离的非重复51株SMA对左氧氟沙星、环丙沙星、哌拉西林、头孢他啶、头孢哌酮/舒巴坦、庆大霉素、红霉素和磺胺甲唑8种抗生素的耐药情况，通过建立SMA生物被膜的体外模型，测定其对生物被膜的抑制浓度（BIC），与相应抗生素的最低抑菌浓度（MIC）进行比较。通过扫描电镜观察抗生素作用后细菌生物被膜的形态学变化。结果：51株SMA对8种常用抗生素的耐药率分别是13.73%、82.35%、54.90%、50.98%、70.59%、82.35%、94.12%及45.10%；其中42株SMA利用微量接种针成功建立成熟生物被膜的体外模型；菌珠形成生物被膜后，每种抗生素的耐药菌株数和耐药程度均大幅度增加。结论：本地区分离的SMA具有耐药谱广、耐药率高特点；左氧氟沙星和头孢哌酮/舒巴坦对SMA有较强的抗菌活性。形成生物被膜后的SMA较浮游态细菌对抗生素的耐药程度增加。

嗜麦芽窄食单胞菌 抗药性，微生物 微生物敏感性试验 半数抑制浓度 生物膜 抗菌药 显微镜检查，电子,扫描 天津

嗜麦芽窄食单胞菌（SMA）是医院获得性感染和慢性呼吸道感染的重要病原体之一，在非发酵菌中的分离率仅次于铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌[1-2]。目前国际上对铜绿假单胞菌的生物被膜（BBF）研究较多，但对SMA-BBF的研究较少。本研究主要测定临床常用抗生素对SMA的最低抑菌浓度（MIC）及其生物被膜抑制浓度（BIC），借助扫描电镜观测SMA形成生物被膜前后的结构改变，旨在为临床合理选用抗生素提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）实验菌株：收集2002年7月—2009年7月天津医科大学总医院、天津医科大学第二医院、天津医科大学肿瘤医院、天津市第一中心医院、天津市环湖医院、天津市第三中心医院、天津市第四中心医院及天津市胸科医院8家三级甲等医院SMA，均做常规生化试验鉴定，质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC25923、铜绿假单胞菌ATCC27853和大肠杆菌ATCC25922。（2）抗生素：左氧氟沙星（LEV）、环丙沙星（CIP）、哌拉西林（PIP）、头孢哌酮/舒巴坦（SCF）、庆大霉素（GM）、红霉素（ERY）及磺胺甲恶唑（SXT）标准品均购自北京天坛药物生物技术开发公司，头孢他啶（CAZ）标准品（葛兰素史克制药公司）。（3）培养基 ：水解酪蛋白肉汤（MHB）、普通营养肉汤及M-H琼脂（MHA）均购自中国药品生物制品检定所。

1.2 嗜麦芽窄食单胞菌的临床资料及药敏分析 分析SMA临床株的数量、标本来源情况；采用微量肉汤稀释法测定SMA对8种抗生素的MIC，实验结果依据2006年版美国临床和实验室标准化协会（CLSI）判定标准进行判定。

1.3 BIC的测定 用微量接种针培养细菌生物被膜。将含有SMA肉汤的菌浓度调至3×1011CFU/L，稀释100倍。取稀释后的菌液100 μL加入96孔板中（留有空白孔），将接种针插入上述96孔中，后放入35℃孵箱中培养。24 h后取出接种针用pH 7.3的磷酸盐缓冲液冲洗3次。将冲洗后的接种针压入备用的内含8种抗生素的药敏板中，每孔含100 μL，留有空白菌液孔，四周用封口膜密封，35℃培养。24 h后取出接种针再次冲洗。将冲洗后的接种针转入含有100 μL MHB的96孔板中，四周用封口膜密闭，超声振荡20 min使生物被膜从接种针上完全剥离到肉汤中。移除接种针换为普通的上盖，立即于酶标仪在620 nm波长下读取光密度值（OD0h）。随后将此96孔板放入35℃中孵育6 h，再次测定其相应波长下的光密度值（OD6h）。成熟BBF形成的判断标准：空白菌液孔孵育6 h前后的平均OD差值（OD6h-OD0h）≥0.05；抗生素的BIC为低于阳性对照孔OD值10%的抗生素浓度。实验结果依据2006年版CLSI判定标准进行判定。

1.4 扫描电镜（SEM）鉴定细菌生物被膜的形成及形态学变化 分别取SMA菌液中培养24 h的硅胶膜片以及抗生素作用后的硅胶膜片，在低温的戊二醛磷酸盐缓冲溶液经过固定、冲洗、脱水、置换、干燥及表面喷金镀膜，通过SEM观察BBF在放大1 000~20 000倍下的微观形态。

2 结果

2.1SMA标本分离部位的来源情况 共收集51株，其中痰液39株（76.47%）、尿培养4株（7.84%）、支气管灌洗液2株（3.92%）、血培养2株（3.92%）、咽拭子1株（1.96%）及其他标本3株（5.88%）。

2.2 对8种抗生素的药敏实验结果 51株SMA对8种常用抗菌药的耐药性分别是LEV 13.73%（7/51）、CIP 82.35%（42/51）、SCF 70.59%（36/51）、PIP 54.90%（28/51）、CAZ 50.98%（26/51）、GM 82.35%（42/51）、ERY 94.12%（48/51）、SXT45.10%（23/51）；未见对所测抗生素全部敏感的菌珠，对2种以上抗菌药物耐药的临床菌47株（92.16%）。

2.3 SMA对抗生素的耐药情况及敏感性变化 42株SMA培养后可形成成熟的生物被膜，对8种抗生素的耐药情况及其相应的BIC，见表1、2。42株嗜麦芽窄食单胞菌形成生物被膜前后的MIC值和BIC值情况，见表3。抗生素半数BIC（BIC50）分别高于相应抗生素的半数 MIC（MIC50）；90%BIC（BIC90）也均高于相应的90%MIC（MIC90）。

表1 42株SMA对8种抗生素的耐药情况

表2 形成生物被膜后42株SMA对8种抗生素耐药情况

表3 生物被膜形成前后42株SMA对8种抗生素的敏感性变化 （mg/L）

2.4 培养24 h硅胶膜片SMA生物被膜扫描电镜结果 可见大量段杆状SMA聚集成簇并分泌大量胞外多糖基质—黏液丝状物而彼此相联成网状结构，黏液丝间穿插着大量的细杆状菌体，自身部分或整体被分泌的胞外基质包裹，有些细胞处于分裂期，有些胞体处于凋亡期，见图1。菌株空白对照表面呈不规则的波纹状起伏，未见有细菌胞体的黏附，见图2。

2.5 细菌生物被膜在左氧氟沙星作用下形态学的变化 在抗生素作用下，细菌生物被膜的完整结构被破坏，细菌黏附数量减少，菌体间的多糖基质稀薄，可见部分胞体已经处于死亡裂解态形态；空白对照硅胶膜片上BBF形态仍然完整成熟，见图3、4。

3讨论

近年来SMA已成为医院获得性感染的常见病原体，本研究收集51株SMA，其中39株分离自痰标本，2株来自支气管灌洗液，表明SMA引起的感染以呼吸道为主，可能与呼吸系统较适于SMA寄居生长和向下呼吸道传播感染有关，这与国外报道一致[3-5]。药敏测定结果显示，SMA的耐药谱广，耐药率较高，且多重耐药株常为高水平耐药。

目前随着临床上生物医学材料的广泛使用，生物被膜相关性SMA感染也日益增多[6-7]。BBF是细菌产生多糖蛋白复合物将自身包绕并黏附于无活性物体或活体表面而形成，有一定立体结构。本研究采用微量接种针为载体，进行体外构建嗜麦芽窄食单胞菌的生物被膜，并且通过比较细菌胞体及其分泌物在抗生素作用前后的光密度差值变化来定量判断耐药情况的变化，结果证实受检的51株SMA中有42株可形成成熟的生物被膜，扫描电镜下证实细菌生物被膜是一个不均质性的细胞群居体。

目前CLSI标准中微量肉汤稀释法仅仅是对暴露的、浮游状态的细菌所做的抗生素敏感试验，即测定相应抗生素的MIC值。但其不能准确地评估生物被膜细菌数量以及抗生素对生物被膜细菌的敏感性，所以，其生物被膜形成的程度、定量检测的标准与临床感染的关系仍无法得知。本研究采用的微量接种针的形态大小直径均相同，且在等量的菌液条件下培养，提供了形成相同的细菌生物被膜形态的先决条件，可以精确到相应生物被膜抑制浓度的数值,真实反映抗生素对BBF细菌的抑制浓度。根据相应的BIC值证实，形成生物被膜后，部分敏感菌株转变为耐药株，细菌对每种抗生素的耐药程度均大幅度增加；而且扫描电镜下进一步证实细菌生物被膜在抗生素作用下，虽然成熟形态被破坏、部分胞体已经处于死亡裂解态，但是仍可见到正常的细菌胞体，继而再次繁殖产生耐药；因此形成生物被膜，也是细菌对抗生素产生耐药性的机制之一。综上所述，本地区分离的SMA具有耐药谱广、耐药率高特点；与单个细菌相比，形成生物被膜后SMA对抗生素的耐药程度增加。

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In Vitro Susceptibility Assay of Biofilm Formation of Stenotrophomonas Maltophilia

LIANG Gehong,SONG Shiduo,SUN Erlin，WANG Zhe,QI Wei

Institute of Infectious Diseases,the Second Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300211，China

Objective:To investigate the current situation and resistance ofStenotrophomonas Maltophiliaclinical(SMA)strains collected from Tianjin area,and investigate the effects of antibiotics on the SMA biofilms.Methods:The distri⁃bution and drug resistant situations of 51 isolated clinical strains of SMA were analyzed.Subsequently,the model of SMA bio⁃films in vitro was developed,challenged by antibiotics and calculated biofilm inhibitory concentrations,and to observe the change of biofilms by scanning electron microscopy.Results:The resistance rates of SMA to 8 kinds of commonly used anti⁃biotics were as following:13.73%,82.35%,54.90%,50.98%,70.59%,82.35%,94.12%and 45.10%,of which,42 strains could be formed bacterial biofilms.After the formation of biofilm,the antibiotic resistance and resistance strains increased substantially.Conclusion:SMA may be one of the most important pathogenic bacteria in Tianjin area,with features of high drug resistance rate and multidrug resistance.The susceptibility test demonstrated that levofloxacin and cefoperazone/sulbac⁃tam had a high level of antimicrobial activity.Comparing to planktonic bacterial growth,SMA growing as biofilms proves to be highly resistant to most antimicrobials.

stenotrophomonas maltophilia drug resistance,microbial microbial sensitivity tests inhibitory con⁃centration 50 biofilm anti-bacterial agents microscopy,electron,scanning TIANJIN

10.3969/j.issn.0253-9896.2011.08.008

*天津市高等学校科技发展基金项目（项目编号：20050210）

300211 天津医科大学第二医院感染性疾病研究所△

E-mail：qiweiwyx@yahoo.com

（2010-10-29收稿 2011-01-11修回）

（本文编辑 陆荣展）