现代全自动血液分析仪检测技术的发展和应用

2010-12-05高枫

中国医疗器械杂志 2010年6期

【作者】高枫

北京积水潭医院器械科，北京，100035

1 血细胞分析仪的发展历史

血细胞分析仪的发展已有50年的历史了。国内医院应用血细胞分析仪对血常规进行检测也基本上普及了。提供更加方便适用、更多功能和参数、更加准确、更快速度的血细胞分析仪，已经是各设备生产商的目标。

电子血细胞计数仪自50年代Coulter发明阻抗式计数仪后，迈出了白细胞（WBC）、红细胞（RBC）自动计数应用于临床的第一步。1976年，Coulter-D及其4A/7A分离式与流动式血细胞计数仪的出现，使WBC、RBC和血小板（PLT）计数全自动化。同时，各种单一技术型的血细胞分类仪不断涌现，如检测细胞化学反应的Hemalog D和 Hemalog D-90，基于细胞图象识别的Hemetrak等。1984年，出现了Technicon H、Sysmex NE-8000和Coulter-S4型血液分析仪器，使CBC及DC开始全自动化。80年代后期，Technicon H、Sysmex NE-8000和Coulter-VCS实现联合检测。流式细胞仪（Flow Cytometry）的制成，使血细胞自动分析仪的参数更趋完善、准确和特异性，而且功能和作用不断增加，为血液研究提供了更多途径。

2 现代血液分析仪的发展特点

(1)血液分析仪的多参数化

近年来，许多血细胞分析仪都在不断增加新的参数，以满足临床在诊疗和鉴别诊断方面的需求。最初的血细胞计数仪仅仅能够计数红细胞和白细胞，后来又有了血红蛋白（HGB）、血小板(PLT)、红细胞压积（HCT）、平均红细胞体积（MCV）等几个参数。在发展成为血细胞分析仪后，又增加了许多分析和计算参数，如白细胞三分群、白细胞五分群、血红蛋白浓度分布宽度、异常淋巴细胞提示和幼稚细胞提示等。有些仪器甚至可以提供40-50种测量或计算参数。

(2)血液分析仪的多功能合成扩展

血细胞分析仪已经不仅仅局限在进行常规血细胞的分析，近年来它增加了许多扩展的功能。例如将网织红细胞（RET）的计数和分析功能加入其中，增加了幼稚细胞分析和有核红细胞分析的功能，甚至对血液细胞中的某些寄生虫进行提示等。更有一些仪器把流式细胞分析仪的某些功能合并到血细胞分析仪上，这样在进行常规血细胞分析时就可以得到某些淋巴细胞亚群的分析结果。

(3)血细胞检测方法的改进和发展

为了做到更加准确的计数和分析、更多的测定和分析参数，血细胞测定和分析的方法已经不局限于某一种单一的方法，如传统的电阻抗法或后来应用的激光散射法，还加了多项技术的相互联合应用。这我们将在下面作重点介绍。

(4)血球分析仪检测速度的提高

许多仪器由于增加了自动进样系统，测定速度加快，一般可以达到每小时80-100个样本。在不包含网织红细胞检测的情况下，Coulter CEN-S System 2型每小时可测定105个标本；Bayer ADVIA 120每小时测定120个标本。这些仪器都可以在自动成批进样的同时，随即插入急诊检验的标本。

(5)应用的方便性

对于操作者来说，仪器最大的优越性还应该体现在操作的方便性和灵活性上。例如，仪器可以使用静脉血或末梢血；可以采用全自动进样系统，也可使用单独闭盖或开盖取样系统；对项目可做适当的组合，如可以选择CBC方式：CBC+DIFF 、RET方式；条码应用给标本编号提供了方便，仪器通过自动扫描条码鉴别标本的来源，为检验数据的电子化提供了极大方便，也减少了编号带来的差错。

3 血细胞分析仪检测技术的应用

血细胞分析仪不同的检测原理，主要是为了满足白细胞分类计数的需要。最早使用的电阻抗原理，只能检测出血细胞计数和白细胞的3分类结果。而今天高档的血球分析仪，已将多项检测技术联合用于对血细胞的检测，通过综合分析检测数据，得出更为准确的血细胞计数和白细胞五项分类结果，同时可提供较多的提示信息，便于操作人员有重点、有目的地对有问题的标本进行显微镜复检。现将有代表性的主要几种普遍使用的血细胞检测方法介绍如下。

3.1 白细胞分类检测技术

3.1.1 VSC（体积、电导、光散射）检测原理

VSC技术可使血细胞未经任何处理,在与体内形态完全相同的自然状态下得出检测结果。首先，标本内加入只作用于红细胞的溶血剂使红细胞溶解；然后，加入抗溶血剂起中和前溶血剂的作用，使白细胞表面、胞质及细胞大小等特征仍然保持与体内相同的状态；最后，使溶血后制体内剩余的白细胞单个通过检测器，接受VSC三种技术的同时检测。为什么要采用鞘流技术，主要是因为能大幅提高监测精度，能够从物理上最大限度的减少细胞的重合现象。当检测孔感应区内同时存在2个以上细胞同时经过检测孔时，细胞1和细胞2的信号作为一个大脉冲信号被检出，其结果为这两个细胞被视为一个细胞，产生漏计想象。细胞浓度越高，漏计数也越多，所以开发出了鞘流法。鞘流技术可用于两种细胞计数原理：一种为电阻抗原理，鞘流通过小孔的敏感区进行细胞计数；另一种为激光计数原理，细胞液流室较长，与激光束垂直相交，激光光束对流经的每个细胞照射后产生散射进行细胞计数。

① Volume（体积）检测技术使用电阻抗原理，对细胞的体积进行检测，根据体积大小来区分不同的细胞。当细胞进入小孔管时，产生的脉冲峰的大小依细胞体积而定，脉冲的数量决定于细胞的数量。但是小淋巴细胞与成熟的嗜酸性粒细胞大小相似，未成熟的淋巴细胞和成熟的嗜中性粒细胞体积相似，因此，仅用体积检测法还不能准确地进行白细胞分类。

② Conductivity（电导）检测技术根据细胞壁能产生高频电流的性能，使用高频电磁探针测量细胞核与胞浆的比例、细胞内颗粒的大小和密度，来区分不同类型的细胞。因此，可用电导性来区分体积相同而性质完全不同的两个细胞群，如小淋巴细胞与嗜碱细胞（体积相似）。当高频电流通过这两种细胞时，由于两者的核浆比例不同而表现出不同的信号，据此而将两种细胞区分开。

③Scatter检测技术不同的细胞被激光照射后对激光的散射量是不同的。光散射对细胞颗粒的构型和质量有较强的鉴别能力，细胞粗颗粒的光散射比细颗粒的光散射更强。入射到细胞上的激光首先在细胞表面产生散射，由此获得有关细胞大小的信息，而入射到细胞内部的颗粒和核上产生散射，由此获得有关细胞内部的信息。通常，散射角度越低，所含有关细胞大小的信息越多，散射角度越高，所含细胞内部的信息越多。所以，如果从一个细胞能够同时检测出低角度散射光和高角度散射光，则可从两个独立参数得到散点图。根据光散射的量可将嗜酸嗜碱及中性粒细胞区分开来。

根据以上三种检测技术所得的数据，经仪器内部的计算机处理后得出细胞分布的散点图，可从图中观察细胞的群落。

3.1.2 阻抗与射频技术联合检测原理

使用该原理的仪器（如SE-900）是通过几个检测通道对白细胞进行分类计数的。

（1）嗜酸检测通道通过分血器样本进入嗜酸通道，血液与特异性嗜酸溶血剂混合，由于其特殊的PH,使得除嗜酸以外的细胞溶解或皱缩，只有嗜酸性粒细胞保持原状。此类细胞可使用直流电阻抗原理进行检测。

（2）嗜碱检测通道计数原理与嗜酸通道原理一样。由于碱性的溶血剂中只能保留血液中的嗜碱性粒细胞，因此根据脉冲的多少即可求得嗜碱性粒细胞数。上述两种方法除需使用专一的溶血剂外，还需特定的作用温度和时间。

（3）DIFF（分类）检测通道该通道同时使用直流电阻阻抗原理和射频检测原理联合对WBC进行检测。DC（直流电阻抗）技术可测定细胞的大小，但无法穿透细胞浆；射频检测技术可透入细胞内，对细胞核的大小和颗粒的多少进行测定。溶血剂将红细胞破坏，但对白细胞作用较轻；溶血剂穿透细胞膜，仅使少量的胞浆溢出，对核皱缩作用也较轻微，细胞形态改变不大。在小孔的内外电极上存有直流和高频两个发射器，由于直流电不能透过细胞浆，仅能测量细胞的大小，而射频可透入细胞内，测量核的大小及颗粒的多少。因此，细胞进入小孔时产生两个不同的脉冲信号，脉冲的高低分别代表细胞的大小和核及颗粒的密度，以DC 信号为横坐标，RF为纵坐标，就可根据两个信号作为一个细胞定位于二维的细胞散点图上。由于淋巴细胞、单核细胞及粒细胞的细胞大小、细胞浆含量、浆内颗粒的大小与密度、细胞核的形态与密度不同，DC与RF的脉冲信号有较大的差异，定位在各自散射的区域，通过扫描技术得出各类细胞的比例。

（4）幼稚细胞检测通道由于幼稚细胞胞膜上的脂质较成熟细胞少，在细胞悬液中加入硫化氨基酸后，结合在幼稚细胞膜上的氨基酸较成熟细胞多，且对溶血剂有抵抗作用。在加入溶血剂后，成熟细胞被溶解，如果细胞悬液中有幼稚细胞时，其形态不被破坏，可通过DC/RF原理进行检测。

3.1.3 MAPSS(多角度偏振光散射白细胞分类)检测原理

仪器（如ABBOTT型CD-3500型）应用鞘流原理，用鞘流液按适当比例稀释，白细胞内部结构近似自然状态。由于嗜碱性粒细胞颗粒具有吸湿特性，结构有轻微改变。红细胞内部的渗透压高于鞘液的渗透压，血红蛋白从细胞内游离出来，鞘液内的水分进入红细胞中，而细胞膜的结构仍然完整。由于此时红细胞折光指数与鞘液相同，红细胞不干扰白细胞的检测，白细胞呈单行排列通过激光检测区，在各个方向都有其散射光。MAPSS原理从四个角度检测散射光的强度， ① 0o，前角光散射，用于检测细胞的大小；② 10o，狭角光散射，用于对检测细胞内部结构的复杂程度；③90o，垂直光散射，用于对细胞的核分叶情况进行检测；④90oD，消偏振光散射，根据细胞内的颗粒可将垂直角度的偏振光消偏振的特性，通过检测90oD与90o散射光的强度，将嗜酸从中性粒和其他细胞中分离出来。计算机系统自动将数据进行储存和分析，将WBC分成5群。

3.1.4 光散射与细胞化学技术联合法

使用该原理的仪器（如Bayer120）采用激光散射和过氧化物酶染色技术对WBC进行5分类。

（1）过氧化物酶检测通道嗜酸性粒细胞有很强的过氧化氢酶活性，中性粒细胞有较强过氧化氢酶，单核细胞次之，而淋巴细胞和嗜碱性粒细胞无此酶。如果将血液经过过氧化物酶染色，胞浆内即可出现不同的酶化学反应。经过含有清洗剂和甲醛的高渗液中的孵育，清洗剂使细胞破坏，甲醛使WBC内的酶被固定。然后，加入染液（H2O2和4-氯-萘酚）并加热，使得细胞内含有的过氧化物酶分解并现色沉积定位与酶的反应部位。当细胞通过检测区时，根据酶反应强度（阴性、弱阳性、强阳性）和细胞体积的差异，以及细胞被激光照射后光散射强度的差异，对不同类型的WBC进行区分。以吸光率的强度（酶反应强度）为横轴，光散射强度（细胞体积）为纵轴，将每个被检测细胞的分布情况表示于散点图上。

（2）嗜碱性粒细胞/分叶核检测通道该通道用于嗜碱细胞计数和中性粒细胞核分叶程度的分析。分析过中RBC/Platelet检测使用共同的通道，但在不同的时段检测。检测前，酸性表面活性剂作用于血细胞，将RBC溶解，除嗜碱细胞外，其他类型的WBC也被破坏，致使胞浆溢出，仅剩裸核。当细胞进入检测通道时，根据激光照射细胞产生的前向角和散射角的变化以及不同的裸核结构可将嗜碱细胞从WBC中区分出来。

3.1.5 荧光染色流式细胞术

流式细胞计数法只需要很少的样品就可对这些细胞和粒子进行检测。一个血液样品经过吸液和定量、稀释至指定的稀释比，并进行染色，然后将该样品送入流动池中。检测中使用的鞘流装置改进了细胞计数的准确性和重现行。同时，由于血细胞颗粒成行通过该流动池中心，故而防止产生异常血液脉冲并可减小流动池的污染。一个半导体激光束通过该流动池照射到血细胞上，前向散射光由光电二极管接受，侧面的散射光和侧面的荧光则由光电倍增管（PMT）接收。光信号被转化为电脉冲，从而可以得到有关血液细胞的信息。如图1所示。

图1 流式细胞计数Fig.1 Counting of streaming cells

（1）前向散射光和侧向散射光当光通路中存在诸如粒子之类的障碍物时，该光束就在每个障碍物的不同方向上产生散射光。通过检测散射光，可以得到有关细胞体积大小和材质的信息。与此相似，当一束激光照射到血细胞颗粒上时就产生光散射，其强度取决于颗粒直径和观察角度这样的因素。对前向散射光进行检测，提供有关血液细胞体积大小的信息；同时对侧向散射光进行检测，提供有关细胞内部（如细胞核的体积大小）的信息如图2所示。

图2 前向和侧向散射光，提供细胞大小和内部结构的信息Feg.2 Forward and side scattered light,which can provide information about cell size and internal structure

图3 荧光染色流式细胞Fig.3 Fluorescence staining cells

（2）侧向荧光荧光信号是由荧光染料受激发后发出的。以特异性的荧光染料对细胞的特定成分染色后，定量测量细胞所发出的荧光强度，就可以确定细胞中的特定成分的含量。经染色后的细胞在激光束的照射下，荧光染料吸收能量能级跃迁，再短暂的延迟后返回基态并发出荧光。由于荧光波长比散射光长，因此，可以利用特定波长的双色性反射镜盒带通滤光片将同一方向上的测向散射光与荧光区分开。随着染色集团浓度的增加，荧光强度也增加，通过测量荧光强度，可以得到有关血细胞染色的信息，如图4所示。荧光向所有方向辐射，不同厂家不同型号的仪器选择不同方向荧光进行检测，如图3所示。

图4 荧光和侧向散射光提供细胞内部结构和核酸多少的信息Fig.4 Fluorescence and side scattered light to provide the internal structure of cells and the number of nucleic acids

例如，在4 DIFF通道检测时，特殊溶血素将红细胞及血小板破坏，并在WBCs膜上打出小孔，染料进入破损的WBCs并与核酸结合（RNA/DNA）。正常情况下，白细胞除嗜碱性粒细胞外，分为中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞。当出现异常细胞时，由于各类细胞的核型不同，胞浆内DNA/RNA的含量不同，因此在分类散点图所占的位置就不同，如图5所示。其他参数，如BASO、RET和IMI等在其相应的检测通道中进行检测，通过不同的试剂作用选用不同的检测参数，最终确定其检测值。

图5 DIFF散点图Fig.5 DIFF Scatter gram

3.2 RBC/PLT的测定

3.2.1 鞘流DC检测方法

对RBC/PLT检测大部分采用鞘流DC检测的方法。所谓DC就是经典的小孔电阻阻抗法，又名库尔特原理。血细胞是相对于电解质溶液的不良导体，当其悬浮于溶液中通过检测微孔时，改变了微孔内外两侧电极之间原来恒定的低频电流，其瞬间引起微孔电压的变化而形成电压脉冲。脉冲的数量代表了通过微孔的细胞数量，脉冲的振幅高低表示细胞的体积。鞘流法是指在检测器内，样品喷嘴定位在孔的前面且与中心对齐，将稀释后的样品由喷嘴推入锥形室后，由前鞘流内的试剂包裹通过小孔的中心。通过小孔以后，经过稀释的样品由后鞘流中的试剂包裹送入捕集管中。这样，可以防止该区域的血细胞回流，并防止产生假性血小板脉冲。鞘流方法改善了血液计数的准确性和重现性。同时由于血细胞通过在一条直线上的小孔，所以也可以防止产生异常血细胞脉冲，如图6所示。

图6 鞘流法Feg.6 Sheath flow

体积不同的红细胞、白细胞和血小板，其产生的脉冲幅度也不同，排列顺序以白细胞最大，红细胞次之，血小板最小。在计数红白细胞时，可利用一个幅度鉴别电路将血小板筛选出去。这个鉴别电路叫阈值选择电路。红细胞计数时由于正常人体外周血红细胞的数目为白细胞的1000倍左右，所以选择相应的阈值时，白细胞产生的脉冲可以完全忽略，红白细胞总数可视为红细胞数。选择相应的血小板阈值电压,去掉血小板的干扰信号,并计数红白血细胞和血小板的总数。最后，从总数中减去红白细胞数,即为血小板数。

3.2.2 流式细胞检测法

有些仪器采用流式细胞检测技术测定红细胞及血小板，如 BAYER120系统。将血样通过分血阀引入RBC/PLT反应池中，加入试剂将红细胞不规则的形状变为固定的球形，从而消除细胞形态对体积测定的影响。当通过流动室时，激光照射在每一个细胞上产生的低角度（2o-3o）与高角度（5o-15o）的散射光分别得到红细胞的体积与血红蛋白的浓度信息。检测到的低角度散射光被放大30倍得到血小板的体积信号；检测到的高角度散射光被放大12倍，得到血小板的折射信号，通过这些信号血小板被确定。其中得到的血红蛋白值,可以与仪器所采用的经典血红蛋白测定值进行对比参考,对特殊病例样本的血红蛋白值的检测提供了更多的研究参数。

3.3 HGB的测定

用于自动测量血红蛋白的主要化学方法，为氰化高铁血红蛋白方法和氧化血红蛋白方法。

氰化高铁血红蛋白测定方法，是1966年由国际血液学标准委员会（ICSH）作为一种国际标准方法而提出的。由于该方法使用了氰化物，作为试剂它们是有毒的，所以必须对废液进行处理，从而从环保的角度来讲，该方法存在缺陷。

氧化血红蛋白测定方法的血红蛋白转化速度很快，因为血红蛋白很容易转化为氧化血红蛋白。同时由于该方法不使用诸如氰化物这样的毒性物质，所以该方法比较环保。但有研究称，该方法却不能将高铁血红蛋白转化为氧化血红蛋白。对于正常人体血液这并没有问题，但是对于含有大量高铁血红蛋白的样品如控制血液样品，就会导致测量值低于真实值，所以同样存在缺陷。

在仪器中实现对血红蛋的测定通常采用的是比色法测定。它是利用溶血剂将稀释的血液中的红细胞破坏，血红蛋白便溶解出来，在加入转化试剂进而转化为颜色稳定的氰化血红蛋白。血红蛋白的含量越高，它的颜色就越深，透光性就越差（或吸光性越强）。用光电器件检测透射光强度，并与已定标的血红蛋白值相比较，即可得出血红蛋白含量。常用的光路系统为了防止光散射和外来光干扰，均采用双波长法（通常为540 nm及690 nm）测量。当然也有采用激光法测定血红蛋白的，如红细胞测定部分所提到的，利用激光照射在红细胞上时所得到的不同角度散射光，从而得到红细胞内部血红蛋白浓度的信息，得到血红蛋白值。但用此方法得到的血红蛋白值也多用于对传统比色法的血红蛋白值进行比较参考，而很少作为最终的报告结果。

3.4 网织细胞及幼稚细胞等特殊细胞的检测：

3.4.1 网织细胞的检测

现在大部分仪器都采用荧光染色流式细胞检测方法对网织细胞进行检测，如SYSMEX-2100及BAYER120等仪器。通常此检测占用仪器的一个检测通道，加入特殊试剂，使红细胞、白细胞的体积膨胀，同时使细胞膜轻微受损，便以染液进入细胞内。当染液进入细胞内后，其中的荧光染料对细胞内的DNA、RNA进行染色。成熟红细胞与网织红细胞胞浆内的RNA含量不同而被区分，网织红细胞与白细胞因胞浆内的DNA和RNA含量不同而被区分。另外，由于血小板也有一定的荧光强度，因此也可以与小红细胞及红细胞碎片区分，得到光学法测定的血小板值。

3.4.2 NRBC的检测

对于有核红细胞的检测，也是采用荧光染色流式细胞检测。试剂将成熟的红细胞破碎，有核红细胞的核裸露，同时在白细胞上打孔，染液进入白细胞内对核酸（核膜）进行染色。由于嗜碱性的有核红细胞相比其他的红细胞有较高的荧光强度，而白细胞的荧光强度大于有核红细胞，根据体积及荧光强度的大小将有核红细胞区分出来。试剂反应过程及作用如图7所示。

图7 NRBC试剂作用示意图Fig.7 NRBC Reagents diagram

3.4.3 IMI细胞的检测

SYSMEX-2100是采用RF/DC检测法，在其单独通道中利用成熟粒细胞胞膜表面含较多量的脂质及少量的蛋白质而幼稚粒细胞膜表面则相反的原理进行检测的。检测时，加入相应试剂破坏细胞膜，导致成熟粒细胞膜破坏而幼稚粒细胞膜部分受损，从而使燃料进入与细胞内容物相结合，不同的幼稚粒细胞对试剂的作用有所不同。用直流电阻抗法测定细胞的大小，而射频则透入细胞内测量细胞核的大小及核与胞浆的密度，因而在以射频信号为纵轴，直流信号为横轴IMI散点图上，不同细胞体积和核的密度及大小的细胞占据的位置不同。通过直流电阻的变化测定血细胞的大小，而由射频电阻的变化检测血细胞内的密度（细胞核的大小与其它信息），从而得到各种相关检测数据，将幼稚粒细胞进行辨别。