初发Graves病患者CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞水平的研究

高桂华，赵连爽

（中国医科大学 附属第一医院检验科，沈阳110001）

Graves病（Graves’disease，GD）是一种器官特异性自身免疫病，即突眼性甲状腺肿。80%患者体内存在抗促甲状腺激素刺激激素受体抗体（thyrotrophin receptor antibody，TRAb），最显著的病理组织学特点是甲状腺、眼睛等效应器官内淋巴细胞的浸润，浸润细胞中存在自身反应性T细胞［1］，这些自身反应性T细胞与特异性损伤密切相关，并在Graves病的发生和发展中起重要作用。CD4+CD25+调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）具有免疫抑制功能，能够抑制CD4+CD25-效应性T细胞的增殖，从而抑制人及实验动物体内的自身反应性T细胞的增殖［2］。Foxp3（forkhead/winged helix family transcriptional repressor）是最近发现的Tregs的特征性标志［3］。本实验以胞内染色技术和流式细胞术定量检测和分析Graves病患者外周血中Tregs的数量和免疫抑制功能变化。

1 材料与方法

1.1 研究对象

45例初发GD患者（GD组，男性13例，女性32例）均来自中国医科大学附属第一医院门诊或住院部，所有患者均未经治疗，临床表现为甲状腺弥漫性肿大，双眼球突出，代谢亢进，平均年龄40.5岁（27～55岁）。20例健康体检者（对照组，男性5例，女性15例），平均年龄38岁（24～52岁），无自身免疫疾病及家族史。年龄、性别在两组之间差异无统计学意义。所有患者及健康体检者均签署知情同意书，本研究经中国医科大学伦理委员会审核批准。

1.2 试剂和仪器

抗CD3-Percp、抗CD4-APCcy7、抗CD25-APC购自BD bioscience，Foxp3-PE kit购自ebioscience。流式细胞仪为BD FACSArial。

1.3 实验方法

EDTA抗凝管抽取5 ml外周静脉全血，Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），计数2×106个细胞，加入 CD3、CD4、CD25抗体各10 μl，4℃避光孵育25 min，洗涤2次，加入1ml Fix/permeabilizatioin，4℃避光孵育30 min，Perm Wash2ml洗涤1次，加入20 μl Foxp3抗体，4℃避光孵育25 min，Perm Wash2ml洗涤1次，加入150 μl多聚甲醛固定，上机分析，每个样本获取1×105个细胞，所有结果以占CD4+T细胞百分比表示。放射免疫分析法检测TT3，TT4，TSH，检测方法按照试剂及仪器说明书。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 甲状腺激素水平

GD组与健康对照组相比，TT3、TT4水平明显高于健康对照组，TSH水平低于健康对照组。见表1。

2.2 调节性T细胞水平

GD 组 CD4+CD25+T细胞［（4.9±1.6）%］水平明显低于健康对照组［（8.9±2.9）%］（P<0.05），CD4+CD25+Foxp3+调节性 T细胞［（3.2±1.7）%］水平明显低于健康对照组［（6.5±3.6）%］（P<0.05），CD4+Foxp3+T 细胞［（4.6±2.2）%］水平也明显低于健康对照组［（7.3±4.3）%］（P<0.05）。

3 讨论

调节性T细胞是具有调节功能的成熟T细胞亚群，因其具有抑制免疫反应的作用，一直被称作抑制性T细胞。Treg的种类较多，依据其发育、特异性及作用机制分为天然Treg与获得性Treg，其中CD4+CD25+Treg是研究较为深入的天然Treg，Treg的特征性的分子标志是Foxp3，它也是Treg不同于活化T细胞的重要特征。

研究显示在自身免疫性疾病中，调节性T细胞水平明显下降［4～6］，对GD患者调节性T细胞水平的变化研究尚少，结果也不尽相同，党珊等［7］发现CD4+CD25+Treg水平下降，而唐大海等［8］则认为GD患者Treg水平无明显变化，主要是Treg免疫抑制功能的降低。本研究结果显示GD患者CD4+CD25+Foxp3+Treg水平明显低于健康成人，与党珊［7］的结果相似，说明在GD患者发病过程中，具有免疫抑制功能的Treg数量减少，可能在一定程度上对于自身反应性T细胞抑制能力降低，在感染或情绪刺激作用下，自身反应T细胞增殖，促进B细胞产生TSH受体抗体，导致GD的发生。

综上，GD患者CD4+CD25+Foxp3+Treg水平明显低于健康成人，提示在GD发病及发展中调节性T细胞可能发挥重要作用，这对于阐明GD的机制可能具有很大意义。进一步，在GD发病早期我们可以通过减慢或阻止Treg数量减少来延缓GD的发展，为治疗GD提供了一种新的思路与可能。

［1］Weetman AP.Autoimmune thyroid disease ［J］.Autoimmunity，2004，37（4）：337-340.

［2］Thornton AM，Shevach EM.Suppressor effector function of CD4+CD25+immunoregulatory T cells is antigen nonspecific［J］.J Immunol，2000，164（1）：183-190.

［3］Shohei H，Takashi N，Shimon S.Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3 ［J］.Science，2003，299（5609）：1057-1061.

［4］Tang Q，Henriksen KJ，Bi M，et al.In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes［J］.J Exp Med，2004，199（11）：1455-1465.

［5］Lee HY，Hong YK，Yun HJ，et al.Altered frequency and migration capacity of CD4+CD25+regulatory T cells in systemic lupus erythematosus［J］.Rheumatology（Oxford），2008，47（6）：789-794.

［6］F觟rger F，Marcoli N，Gadola S，et al.Pregnancy induces numerical and functional changes of CD4+CD25 high regulatory T cells in patients with rheumatoid arthritis［J］.Ann Rheum Dis，2008，67（7）：984-990.

［7］党珊，施秉银.Graves病患者CD4+CD25+调节性T细胞的变化［J］.中华内分泌代谢杂志，2007，23（3）：253-254.

［8］唐大海，徐尔理，吴玲.Graves病患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞的定量及功能分析［J］. 海军医学杂志，2008，29（2）：114-118.