Twist蛋白在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

舒红，张洪兰，赵晓东，姜卫国

（中国医科大学 附属盛京医院病理科，沈阳110004）

非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的发生、发展和侵袭扩散机制目前尚不清楚。扭曲基因（twistgene）是一种碱性螺旋-环-螺旋（basichelix loop helix，bHLH）转录因子，主要表达于鼠及人类等的胎盘、胚胎中胚层和成人的某些中胚层来源的未分化组织。它作为抑制凋亡及上皮-间质转变的重要调控因子在多数肿瘤中的表达已得到了证实。本研究通过检测扭曲蛋白（Twist protein）蛋白在NSCLC组织中的表达，探讨twist基因在NSCLC临床、病理诊断中的作用及其意义。

1 材料与方法

1.1 材料

选择中国医科大学附属盛京医院病理科存档的NSCLC石蜡标本61例作为实验组，其中男45例，女16例。另取癌旁正常肺组织15例作为对照组。根据2004年WHO肺癌分类标准进行组织学分类：腺癌22例，鳞癌36例，腺鳞癌3例；高分化31例，中分化26例，低分化4例。按国际抗癌联盟2009年的TNM分期进行分期：Ⅰ、Ⅱ期共45例，Ⅲ、Ⅳ期共16例。有淋巴结转移25例，发生远处转移3例。所有病例均有完整的随访资料。

1.2 试剂

Twist鼠抗人单克隆抗体（H-81，SC15393）购自Santa Cruz公司，免疫组化染色试剂（SP9002）、DAB显色液（ZLI-9033）购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 检测方法

采用S-P免疫组化法。石蜡切片常规脱蜡，3%H2O2阻断内源性过氧化物酶活性，pH9.0的EDTA缓冲液中经高压锅抗原修复，加入10%的胎牛血清37℃孵育，加Twist单克隆抗体（1∶200稀释）4℃过夜。加生物素标记二抗37℃孵育，加辣根酶标记链霉卵白素工作液37℃孵育，DAB染色，苏木素复染。用PBS代替一抗做空白对照。

1.4 结果判断标准

Twist蛋白表达于细胞质和细胞膜。按染色强度计分：0分为无色，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色；在高倍镜（×40）下取5个不同视野，各计数200个细胞，按阳性细胞所占的百分比计分：阴性为0分，阳性细胞≤10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，﹥75%为4分。染色强度与阳性细胞百分比的积分乘积≥3分为免疫反应阳性，否则为阴性。

1.5 统计学分析

计数资料采用率表示，不同组间比较用χ2检验及Fisher确切概率法；生存率的比较采用Kaplan-Meier法，组间比较采用Log-rank检验，预后因素分析采用Cox分析。用SPSS14.0统计软件进行统计学分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Twist蛋白的表达

Twist在NSCLC中的阳性表达率为72.1%（44/61），明显高于对照组的 6.7%（1/15）（P ＜0.05）。

2.2 NSCLC组织中Twist蛋白表达与临床病理学特征的关系

NSCLC中Twist蛋白表达与组织学类型、临床分期及淋巴结转移有关（P＜0.05），而与年龄、性别、吸烟状况、肿瘤分化程度、肿瘤大小及远处转移无关（P＞0.05）。见表1。

2.3 NSCLC组织中Twist表达与患者术后生存期的关系

对61例患者进行Kaplan-Meier生存分析，结果显示，Twist蛋白表达阴性组患者平均生存期为69.4个月，Twist蛋白表达阳性组患者平均生存期为46.8个月。虽然Twist蛋白阴性组患者生存期高于阳性组，但其差异无显著的统计学意义（图1），Log-rank检验 P＞0.05。

对随访超过4年的48例患者进行Twist蛋白差异性表达的研究发现，Twist蛋白在术后生存时间＜4年的患者中表达较高（P＜0.05）。见表2。

2.3 NSCLC患者术后死亡的Cox分析

患者年龄可直接纳入模型，以下9个变量首先进行赋值：性别（男=0，女=1），吸烟状况（无=0，有=1），肿瘤大小（T1=0，T2=1，T3=2，T4=3），淋巴结转移（无=0，有=1），远处转移（无=0，有=1），临床分期（Ⅰ=0，Ⅱ=1，Ⅲ=2，Ⅳ=3），分化程度（高分化=0，中分化=1，低分化=2），Twist蛋白表达（“-”为0，“+”为1）。赋值后分别进行Cox分析，结果显示对患者术后死亡有显著影响的因子为吸烟及淋巴结转移（P＜0.05），且均为危险因子，而性别、年龄、肿瘤大小、病理分级、临床分期、Twist蛋白的表达对NSCLC患者的死亡无明显影响。见表3。

3 讨论

twist基因是一种高度保守的碱性螺旋-环-螺旋转录因子，在胚胎的中胚层形成，特别是在肌形成中起关键作用［1］。目前已在多种人类上皮来源肿瘤中，如乳腺癌［2，3］、卵巢癌［4］、肝细胞癌［5］、鼻咽癌［6］、前列腺癌［7，8］等，发现 Twist表达增高，并与患者预后关系密切，而在非小细胞肺癌中的研究目前还较少。Twsit促进肿瘤细胞侵袭转移的主要机制在于它可抑制 E-钙黏蛋白（E-cadherin）的转录表达［9］，致使肿瘤细胞容易脱离原发病灶而易于向周围组织侵袭，并为肿瘤的远处转移提供了必要条件。另外，Twist能识别并结合靶基因启动子上E-box基序的DNA结合序列诱导上皮-间质转变［10］。

本研究通过对NSCLC及癌旁正常肺组织中Twist蛋白的表达进行检测分析，证实Twist蛋白在肺癌中表达阳性率显著高于对照组（P＜0.05），与Song在鼻咽癌中的研究结果相同［6］。Twist蛋白阳性表达与NSCLC的临床分期、淋巴结转移呈显著正相关（P＜0.05）。同时，Twist蛋白在鳞癌中的表达明显高于腺癌的表达，可能与鳞癌具有更强的侵袭和转移能力有关，这有待进一步探讨。结果还显示了发生远处转移的NSCLC中Twist蛋白的表达率达100%（3/3），而Fisher确切概率法得到的P值却是大于0.05，这可能与标本构成中远处转移的样本数量太少有关。

由于Twist对肿瘤发生和远处转移具有促进作用，因而可能对患者预后产生不良影响。本研究中Kaplan-Meier生存曲线证实了Twist蛋白阳性表达患者术后生存率较低，但Log-rank检验P＞0.05，可能与样本量较小有关，相信大样本研究可得到有统计学意义的结果。

同时，我们对随访时间≥4年的48例患者进行了Twist蛋白表达结果的比较，发现生存时间≥4年的患者的Twist蛋白阳性表达率明显低于生存期＜4年的患者，Twist蛋白阳性表达与患者长期生存的预后显著相关。

Cox分析表明，吸烟及淋巴结转移是影响NSCLC患者预后的独立危险因子。大多数肿瘤的预后都是多因素作用的结果，而吸烟可以作为NSCLC的预后独立因素，再一次验证了吸烟的危害性。同时，淋巴结转移也是影响预后的一个独立因素，提示在手术过程中必须认真清除各组淋巴结。

本研究结果提示，twist基因很可能是NSCLC发生发展中一个新的重要基因，也是与患者长期预后有关的一个重要因素。twist基因所参与的信号通路及与其他信号通路的对话仍有待进一步研究。

［1］Baylies MK，Bate M.Twist：a myogenic switch in Drosophila［J］.Science，1996，272（5267）：1481-1484.

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［3］GortEH，SuijkerbuijkKP，RoothaanSM，etal.MethylationoftheTWIST1 promoter，TWIST1 mRNA levels，and immunohistochemical expression of TWIST1 in breast cancer［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2008，17（12）：3325-3330.

［4］Kajiyama H，Hosono S，Terauchi M，et al.Twist expression predicts poor clinical outcome of patients with clear cell carcinoma of the ovary［J］.Oncology，2006，71（5/6）：394-401.

［5］Lee TK，Poon RT，Yuen AP，et al.Twist overexpression correlates withhepatocellularcarcinomametastasisthroughinductionofepithelial-mesenchymal transition ［J］.Clin Cancer Res，2006，12（18）：5369-5376.

［6］Song LB，Liao WT，Mai HQ，et al.The clinical significance of Twist expression in nasopharyngeal carcinoma［J］.Cancer Lett，2006，242（2）：258-265.

［7］KwokWK，LingMT，LeeTW，etal.Up-regulationofTWISTinprostate cancer and its implication as a therapeutic target［J］.Cancer Res，2005，65（12）：5153-5162.

［8］Yuen HF，Kwok WK，Chan KK，et al.TWIST modulates prostate cancer cell-mediate bone cell activity and is upregulated by osteogenic induction［J］.Carcinogenesis，2008，29（8）：1509-1518.

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［10］Zhao J，Wang P，Corsi AK.The C.elegans Twist target gene，arg-1，is regulated by distinct E box promoter elements［J］.Mech Dev，2007，124（5）：377-389.