阿司匹林对人子宫内膜腺癌Ishikawa细胞生长和凋亡的影响

赵冬妮，金英楠，李艳霞，马晓欣

（1.中国医科大学 附属盛京医院妇产科，沈阳110004；2.北京市西城区疾病预防控制中心 生殖保健科，北京100029）

肿瘤的发生、发展涉及多基因及其他多种因素的共同参与，是细胞增殖与凋亡机制紊乱的结果。抑制肿瘤细胞增殖，诱导其发生凋亡在肿瘤的预防和治疗过程中发挥着重要的作用。目前，越来越多的研究表明，非甾体类抗炎药物阿司匹林能够通过抑制细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡而降低胃癌、肺癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤的发生，对肿瘤具有一定的预防和治疗作用［1，2］。本研究探讨了阿司匹林对人子宫内膜腺癌Ishikawa细胞增殖的影响，同时检测其对细胞周期分布和细胞凋亡情况的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

人子宫内膜腺癌Ishikawa细胞株由北京大学病理生理教研室提供。阿司匹林购自美国Sigma公司；DMEM培养基购自美国Santa Cruz公司；胎牛血清购自德国Chrome公司；四甲基偶氮唑蓝（MTT）购自美国Amresco公司；RNaseA购自美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：将Ishikawa细胞株置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中贴壁传代培养。

1.2.2 MTT比色实验检测细胞增殖抑制率：取对数生长期的Ishikawa细胞，以每孔5×103个接种于96孔细胞培养板中培养24 h，待细胞贴壁后进行实验。实验组中分别加入含50，25，12.5，6.25，3.125，1.563 mmol/L阿司匹林的培养基，阴性对照组细胞加入无药物的培养基，空白对照组中无细胞只加无药物的培养基。将按上述方法给药的培养板分别培养24，48，72 h 后，吸去上清液，每孔加入20 μl MTT（5 mg/ml）继续培养4 h后，吸去上清液，加入200 μl DMSO，振荡10 min，用酶标仪测定各孔吸光度（A）值。细胞抑制率=（阴性对照组平均A值-实验组平均A值）/（阴性对照组平均A值-空白组平均A值）×100%。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率的变化：取对数生长期的Ishikawa细胞，实验组分别加入含终浓度为1，3，10 mmol/L阿司匹林的DMEM培养基，对照组加入不含阿司匹林的等量DMEM培养基，培养48 h。收集细胞，以70%乙醇固定，加入100 μl RNaseA（1 mg/ml），置于37 ℃水浴30 min 后以 400 μl碘化丙锭（50 μg/ml）染色，置暗处10 min后上流式细胞仪检测细胞周期比例及细胞凋亡率。

1.2.4 透射电镜观察细胞凋亡的形态变化：收取按上述方法（1.2.3）培养后的细胞，加入1 ml戊二醛（2.5%）固定，制成超薄切片，于透射电子显微镜下观察细胞超微结构的变化。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 阿司匹林作用后Ishikawa细胞增殖的抑制率

MTT比色法检测显示，阿司匹林浓度为1.56 mmol/L，作用时间为24 h时，细胞增殖受到轻度抑制（15.99%），随着药物浓度的增加和作用时间的延长，细胞增殖的抑制作用逐渐增强，各浓度及时间点间比较，差异具有统计学意义（P＜0.05），阿司匹林对Ishikawa细胞增殖的抑制作用呈剂量与时间依赖关系（表1）。半数抑制浓度（IC50）为 4.7 mmol/L，因此，以下实验选择浓度为1 mmol/L，3 mmol/L，10 mmol/L。

2.2 阿司匹林对Ishikawa细胞周期分布及凋亡率的影响

流式细胞仪检测结果显示，随着药物浓度的增加，G1期细胞分布明显增加，细胞凋亡率增加，对照组及各浓度实验组间比较差异具有统计学意义（P<0.05）（表2）。

2.3 阿司匹林作用后Ishikawa细胞的形态变化

透射电镜结果显示，对照组细胞呈圆形，体积较大，形态饱满，核内常染色质分布较均匀，细胞表面可见绒毛（图1A）；阿司匹林药物作用后，细胞皱缩明显，染色质于核膜周围边集、固缩，形成新月体或花瓣形，电子密度增强，可见凋亡小体形成（图1B）。

3 讨论

1982 年，Doubilet［3］首次报道了长期服用阿司匹林的人群较普通人群结直肠癌的发病率明显降低，此后数项流行病学调查、动物实验和体外实验都得出了类似的结论。Castano等［4］应用阿司匹林作用于HT229结肠腺癌细胞株，发现HT229细胞的存活率与阿司匹林的剂量和处理时间相关；Moysich等［5］通过临床调查发现，规律服用阿司匹林可有效降低肥胖妇女子宫内膜癌的发病率；Hector等［6］研究发现，阿司匹林能够以剂量依赖的方式抑制体外Ishikawa子宫内膜腺癌细胞株的生长，细胞凋亡是这些变化的机制之一；Shiff等［7］研究发现，阿司匹林可改变结肠癌细胞形态，使细胞聚集在G0/G1期，在一定浓度下诱导凋亡。

近年来，在非甾体类抗炎药物临床应用与研究的过程中，人们发现阿司匹林等具有防治肿瘤的作用。其诱导肿瘤细胞凋亡的相关机制主要分为依赖于环氧化酶-2（cyclo-oxygenase，COX-2）途径和非COX-2途径两大方面。研究认为，COX-2的活性增高可以引起前列腺素 E2（prostaglandin E2，PGE2）和Bcl-2的高度表达，降低E-钙黏蛋白的活性而抑制细胞凋亡、刺激血管生成，从而导致肿瘤的发生，并增加恶性肿瘤的侵袭力。而阿司匹林可通过抑制环氧化酶使花生四烯酸至前列腺素的代谢通路受阻，对肿瘤的发生、发展起到化学预防和治疗的作用。在非COX-2的途径中，研究表明，阿司匹林可通过调节B细胞淋巴瘤/白血病（Bcelllymphoma/leukemia，BCL） 家族，c-myc，p53，caspase 等癌基因和抑癌基因，影响细胞凋亡信号的传导而抑制肿瘤细胞的生长，促进其发生凋亡。

本研究采用不同浓度的阿司匹林作用于Ishikawa细胞，在不同时间下观察其对细胞生长的抑制作用。结果显示，阿司匹林对子宫内膜腺癌Ishikawa细胞的增殖具有明显的抑制作用，随着药物浓度的增加和作用时间的延长，其抑制作用也逐渐增强；同时，阿司匹林能抑制Ishikawa细胞的周期转换，使细胞停滞在G1期，阻碍G1/S期的转换，阻止DNA合成，从而阻碍了细胞的分化和进展。透射电镜下见阿司匹林作用后的细胞发生皱缩，核染色质边集，凋亡小体形成，该形态学变化进一步证明，阿司匹林可触发肿瘤细胞内源性死亡即凋亡的发生。

在恶性肿瘤的发生发展过程中，细胞增殖与凋亡机制的紊乱发挥着重要的作用。本研究结果显示，阿司匹林能有效抑制子宫内膜癌细胞的生长和增殖，诱导其发生凋亡，该药物有望成为临床上治疗恶性肿瘤的又一重要手段。

［1］Thun MJ，Henley SJ，Patrono C.Nonsteroidal anti-inflammatory drugs as anticancer agents：mechanistic，pharmacologic，and clinical issues［J］.J Natl Cancer Inst，2002，94（4）：252-266.

［2］Huls G，Koornstra JJ，Kleibeuker JH.Non-steroidal anti-inflammatory drugs and molecular carcinogenesis of colorectal carcinomas ［J］.Lancet，2003，362（9379）：230-232.

［3］Donowitz M，Pauker SG.Evaluation for colon cancer in patients with occult fecal blood loss while taking aspirin：a Bayesian viewpoint［J］.Med Decis Making，1982，2（2）：147-160.

［4］Castano E，Dalmau M，Barragan M，et al.Aspirin induce cell death and caspase dependent phosphatidylserine externalization in HT229 human colon adenocarcinoma cell ［J］.Br J Cancer，1999，81（2）：294-299.

［5］Moysich KB，Baker JA，Rodabaugh KJ，et al.Regular analgesic use and risk of endometrial cancer ［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2005，14（12）：2923-2928.

［6］Hector A，Arango MD.Aspirin effects on endometrial cancer cell growth［J］.Obstet Gynecol，2001，97（3）：423-427.

［7］ShiffSJ，KoutsosMI，QiaoL，etal.Non-steriodalanti-inflammatorydrugs inhibit the proliferation of colon adenocarcinoma cell：effects on cell cycle and apoptosis［J］.Exp Cell Res，1996，222（1）：179-188.