丝胶预处理对DN大鼠肾脏细胞外基质相关蛋白表达的影响

陈志宏，宋成军，付秀美，付文亮，薛景凤

（承德医学院 基础医学部解剖学教研室，河北 承德06 7000）

近年来糖尿病的发病率逐年上升，其中糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是导致慢性肾功能不全和终末期肾功能衰竭的主要原因［1，2］。DN的典型病理改变为肾小球毛细血管基底膜增厚、系膜细胞增生和系膜基质增多，导致结节性或弥漫性肾小球硬化，这些改变的组织学基础是细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的进行性积聚。ECM积聚由ECM合成和降解两个方面决定，正常生理状态下，ECM产生和降解的动态平衡受到精细调控，糖尿病时由于糖代谢异常和多种细胞因子的参与，导致ECM产生增多、降解减少，引起ECM积聚［3］。本文采用链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）致DN大鼠模型，观察彩色蚕茧提取物——丝胶预处理对DN大鼠肾脏ECM相关蛋白表达的影响，为DN的防治提供理论依据和实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组及处理

清洁级雄性SD大鼠36只，由河北医科大学实验动物中心提供，合格证号：712024。将大鼠随机分为3组：正常对照组、DN模型组和丝胶预防组，每组12只。模型组和丝胶预防组大鼠均采用2%STZ（25 mg/kg，3 d）连续腹腔注射建立动物模型，以血糖≥16.7 mmol/L作为成模标准；丝胶预防组大鼠于注射 STZ 前给与丝胶（2.4 g·kg-1·d-1）灌胃35 d。

1.2 药物与试剂

丝胶由彩色蚕茧（承德医学院蚕业研究所提供）经浸泡、水煎、过滤、浓缩而成。STZ购于美国Sigma公司，临用时用pH 4.4的枸橼酸钠-枸橼酸缓冲液配成2%的溶液；血糖检测试剂盒，保定长城临床试剂有限公司；兔抗转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）抗体、兔抗 Smad3 抗体、兔抗基质金属蛋白酶组织抑制因子-1（tissue inhibitors of maprix metalloproteinases-1，TIMP-1） 抗体，美国Santa公司（购自北京中杉金桥生物技术有限公司）；Ⅳ型胶原 （typeⅣ collagen，cⅣ） 和层黏蛋白（laminin，LN）酶免疫试剂盒，上海森雄科技实业有限公司；BCA蛋白定量试剂盒，北京泰格美科技有限公司。

1.3 检测血液指标

各组大鼠禁食12 h以上，4%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，经内眦于眶后静脉丛采血，3000 r/min离心20 min，收集血清。应用日本日立公司的Boehr inger Mannhe in/Hitachi 717全自动临床生化分析仪采用葡萄糖氧化酶法检测血糖，ELISA法检测cⅣ和LN。

1.4 测定肾质量/体质量

各组大鼠取血前称体质量，取血后断头处死，取双侧肾去掉包膜后称质量，计算肾质量/体质量。然后，一侧肾脏投入液氮中速冻，后移入-80℃冰箱保存，用于Western blot检测；另一侧肾脏入Bounin液固定，用于免疫组化染色。

1.5 肾脏相关蛋白表达的检测

1.5.1 免疫组化染色及定量分析：入Bounin液固定肾脏，常规石蜡包埋，连续切片，片厚5 μm。采用免疫组织化学染色方法检测肾脏TGF-β1和TIMP-1蛋白的表达。一抗为兔抗，稀释浓度为1∶100，DAB显色，苏木素复染细胞核。以PBS代替一抗作为阴性对照，以胞质中出现棕黄色颗粒为阳性反应。采用MiVnt图像分析系统对免疫组化阳性结果进行定量分析：切片在×400显微镜下选取肾小球，计算阳性产物面积占肾小球面积的百分比。每只动物任选3张切片，每张切片选取3个肾小球，取平均值。

1.5.2 肾脏Smad3蛋白表达的检测：取200 mg肾脏组织，提取蛋白，以BCA蛋白试剂盒定量蛋白浓度。采用Western blot方法检测大鼠肾脏Smad3蛋白的表达，蛋白上样量为60 μg。12%SDS-PAGE凝胶电泳、转膜；一抗稀释浓度为1∶200，4℃过夜；Super ECL Plus超敏发光液显影。采用Quantiy One软件对显影条带进行分析，以Smad3条带与βactin条带的灰度比值作为Smad3蛋白的相对表达水平。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠的肾质量/体质量

与正常对照组大鼠相比，模型组大鼠的肾质量/体质量明显升高（P＜0.01）；丝胶预防组大鼠的肾质量/体质量明显低于模型组（P＜0.01）。见表1。

2.2 各组大鼠血液指标检测结果

与正常对照组大鼠相比，模型组大鼠的血糖、cⅣ和LN均明显升高（P＜0.01）；丝胶预防组大鼠的血糖、cⅣ和LN明显低于模型组（P＜0.01）。见表1。

2.3 各组大鼠肾脏Smad3蛋白的表达

在蛋白Marker的55 kDa水平处，可见Smad3蛋白条带；在蛋白Marker的43 kDa水平处，可见βactin条带（图1）。模型大鼠肾脏Smad3蛋白的表达明显高于正常对照组大鼠（P＜0.01），丝胶预防组大鼠肾脏Smad3蛋白的表达明显低于模型组大鼠（P＜0.01）。见表2。

2.4 各组大鼠肾脏TGF-β1蛋白的表达

TGF-β1免疫阳性产物呈棕黄色细腻颗粒状，位于细胞质；TGF-β1免疫阳性细胞包括肾小球囊壁层上皮细胞、足细胞和球内系膜细胞。与正常对照组大鼠相比，模型大鼠肾脏（图2）TGF-β1蛋白的表达明显增高（P＜0.01）；丝胶预防组（图3）大鼠肾脏TGF-β1蛋白的表达明显低于模型大鼠（P＜0.01），见表2。

2.5 各组大鼠肾脏TIMP-1蛋白的表达

TIMP-1免疫阳性产物呈棕黄色细腻颗粒状，位于细胞质，免疫阳性细胞为肾小球球内系膜细胞。与正常对照组大鼠相比，模型大鼠（图4）肾脏TIMP-1蛋白的表达明显增高（P＜0.01）；丝胶预防组（图5）大鼠肾脏TIMP-1蛋白的表达明显低于模型大鼠（P＜0.01）。见表2。

3 讨论

ECM家族有四大成员：胶原蛋白、弹性蛋白质、蛋白多糖和结构糖蛋白。他们不仅是细胞外的惰性充填物，还具有活跃的生物活性，参与细胞的运动、增殖、分化等，并可介导细胞与细胞、细胞与生物分子之间的相互作用，在胚胎发育和各种生理及病理过程中发挥重要作用［4］。机体内有多种细胞因子和酶参与ECM的合成与降解，从而维持正常生理条件下ECM的动态平衡，TGF-β1/Smad3信号通路和MMPs/TIMPs就是其中的重要成员。

TGF-β的胞内信号转导有Ⅰ型和Ⅱ型受体（TGF-βRⅠ和 TGF-βRⅡ）参与；Smad家族蛋白是新近发现的参与TGF-β家族在细胞内信号转导的蛋白质，在将TGF-β信号从细胞表面受体转导至细胞核的过程中起关键作用［5］。TGF-β可通过与自身受体结合，进而磷酸化Smad蛋白并与之形成复合物，激活合成ECM等成分的活性［6］。研究证明，糖尿病大鼠肾脏中TGF-β1/Smda3信号通路处于激活状态，激活的TGF-β1/Smad3信号通路可增加ECM各成分的表达，加速ECM进行性积聚，从而导致肾小球硬化，最终导致终末期肾病的发生［7］。

基质金属蛋白酶（matrix matalloproteinases，MMPs）几乎可以降解除多糖以外的全部ECM成分，其表达下调或者酶活性过度受抑，可引起ECM积聚，导致肾小球硬化［4］。TIMPs是肾内调节MMPs活性的主要物质，它可与MMPs形成MMP-TIMP复合体，阻断MMPs与底物的结合和活化，参与调节ECM的代谢过程。在肾脏对MMPs发挥抑制作用的主要是TIMP-1。DN时，肾脏Ⅳ型胶原和TIMP-1 mRNA的表达明显增强，通过直接抑制ECM降解和降低MMPs的活性，引起ECM降解减少、积聚增加，久之发生肾小球硬化和肾功能衰竭［8，9］。

蚕丝是人类最早利用的天然蛋白质之一，主要由两条丝素和周转覆盖的丝胶两部分组成。以往的研究主要集中在丝素方面，约占茧丝30%的丝胶作为废料丢弃，浪费了大量的生物资源。丝胶的主要成分丝胶蛋白（通称丝胶）为高分子水溶性蛋白，由18种氨基酸组成。目前对丝胶的研究主要集中在美容、护肤、营养与保健等方面；在治疗糖尿病方面的作用，仅有国内学者进行了初步探讨，发现丝胶可有效降低血糖［10，11］。本研究发现，丝胶预防组大鼠血清ECM成分cⅣ和LN的含量、肾脏Smad3、TGF-β1和TIMP-1蛋白的表达明显低于DN大鼠（P＜0.01）。这表明，丝胶预处理可抑制DN肾脏中TGF-β1/Smad3信号通路的激活，防止TIMP-1蛋白高表达导致的MMPs活性的降低，从而预防DN时ECM的积聚和肾小球硬化，对DN的发生发展具有良好的预防作用。由于丝胶是天然的蛋白质，具有生物相容性，可生物降解，对人体无毒性，避免了化学合成药物带给人体的不良反应，因此具有良好的应用推广前景。

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