NK细胞杀瘤活性与肿瘤细胞表面MICA/B表达的相关性研究

王新利，李卿，蒋涛，王扬，付立叶，高婷，姜又红

（中国医科大学 附属第一医院肿瘤研究所第二研究室，沈阳110001）

自然杀伤（natural killer，NK）细胞是先天性免疫系统的重要组成部分，对靶细胞的识别无主要组织相容性复合体﹙major histocompatibility complex，MHC﹚限制性，是机体抗感染免疫、抗肿瘤免疫及清除非己细胞的第一道防线［1］。MICA/B（MHC class I chain-related gene A/B）是NK细胞表面活化性受体NKG2D的配体，在正常情况下，MICA/B仅表达于胃肠上皮中，在感染、应激或癌变等条件下表达上调［2］。Bauer等［3］研究发现正常表达 MHC-I类分子的靶细胞在转染表达MICA后，对NK细胞杀伤的敏感性增强。本研究检测4种肿瘤细胞系细胞表面MICA/B的表达，并探讨其表达与NK细胞杀伤敏感性的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 NK细胞的纯化：取9例健康志愿者外周血，分别取抗凝血20 ml，轻轻叠加于Ficoll上，室温下2000 r/min离心20 min，吸取界面层的外周血单个核细胞（peripheral blood monouclear cell，PBMC）并收集沉淀红细胞，分别用PBS洗涤2次并进行细胞计数。将红细胞和单个核细胞按100︰1混合，1500 r/min离心15 min，弃上清，加1 ml PBS重悬细胞，加入20 μl RosetteSep抗体复合物（1×106PBMC/1 μl RosetteSep抗体复合物），室温下孵育20 min，加入含2%FBS的等体积PBS，轻轻混合，置于等体积的Ficoll上，以2000 r/min离心20 min，吸取界面层细胞，用含2%FBS的PBS洗涤2次并计数细胞，调整细胞浓度为1×106/ml，流式细胞术检测CD3-CD56+细胞的纯度。

1.2.2 细胞培养：NK细胞培养于含10%FBS，500 U/ml IL-2的RPMI1640完全培养基中；肿瘤细胞培养于10%FBS的RPMI1640完全培养基中。细胞均置于37℃，5%CO2培养箱中培养。

1.2.3 肿瘤细胞表面MICA/B的表达：采用直接免疫荧光法测定，收集肿瘤细胞并进行细胞计数，取1×106个细胞，加入20 μl MICA/B-APC 抗体，4℃避光孵育30 min，PBS洗涤3次，用流式细胞仪检测。

1.2.4 CCK-8法测定NK细胞杀瘤活性：以培养24 h后的NK细胞为效应细胞，以对数生长期K562，Bcap37，769P，A549细胞为靶细胞，调整靶细胞浓度为5×104/ml，按效靶比5︰1﹑10︰1﹑20︰1 混合后，在37℃，5%CO2的培养箱中培养24 h，每孔加入15 μl CCK-8，37℃继续孵育2 h，用酶标仪检测450 nm波长OD值，计算杀伤率。杀伤率（%）=［1-﹙实验组OD值-单独效应细胞OD值）/单独靶细胞OD值］×100。

1.3 统计学分析

实验数据采用SPSS13.0统计软件包进行统计学分析。所有数据均以±s表示，多样本均数进行单因素方差分析，差别的多重比较采用LSD法。肿瘤细胞MICA/B的表达与NK细胞杀伤敏感性的相关分析采用双变量相关分析Spearman法。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 NK细胞的分离纯度

2.2 肿瘤细胞表面MICA/B的表达

流式细胞仪检测 K562、Bcap37、769P及 A549表面MICA/B的表达阳性率分别是（60.35±0.50）%、（90.72±0.64）%、（55.59±0.55）%、（3.84±0.10）%，两两比较，差异均具显著性（P＜0.01）。

2.3 NK细胞的杀伤活性检测

NK细胞对同一肿瘤细胞的杀伤活性，在不同效靶比之间，差异有显著性（P＜0.01）；在同一效靶比时，NK细胞对K562、Bcap37及769P的杀伤活性较强，与A549相比有显著性差异（P＜0.01），其中K562与Bcap37之间无显著性差异（P＞0.05）。见表1。

2.4 NK细胞的杀瘤活性与肿瘤细胞表面MICA/B表达的相关性分析

双变量相关分析结果显示，在效靶比为5∶1、10∶1、20∶1 时，K562、Bcap37、769P 及 A549 细胞表面MICA/B的表达与NK细胞的杀瘤活性均呈正相关关系，见表2。对同一肿瘤细胞，随着效靶比增加，相关性增强。

3 讨论

NK细胞是机体天然免疫的主要承担者，其功能受其表面的激活性受体和抑制性受体之间平衡机制的调节。正常情况下，NK细胞通过表面的抑制性受体识别自身的MHC-I类分子，保护正常细胞免受NK细胞的攻击［4］。NK细胞的活化受体NKG2D是C-型凝集素受体成员之一，主要表达在NK细胞、γ ζT细胞及部分CD8+T细胞［5］。MICA/B作为NKG2D的主要配体，是人白细胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）复合体中的MICA基因编码的非经典HLA-I类分子，正常情况下仅在胃肠道上皮细胞表面有少量表达，感染、肿瘤恶性转化等条件能诱导表达。NKG2D与MICA/B结合，在多肽DAP10的介导下激活NK细胞的杀伤活性，并且活化效应能克服靶细胞上经典HLA-I类分子诱导的抑制性效应，在NK细胞的活化中起着非常重要的作用［6］。研究表明MICA表达阳性的肿瘤细胞对NK细胞的杀伤敏感性明显高于MICA阴性者［7］，被转染以MICA/B的肿瘤细胞系对NK细胞杀伤的敏感性明显增强［8］。因此，NK细胞对靶细胞的杀伤活性与靶细胞表面的配体表达关系密切。

本研究发现，K562、Bcap37、769P表达高水平的MICA/B，并且对NK细胞的杀伤比较敏感，而对NK细胞低敏感的A549表面MICA/B的表达水平极低，双变量相关分析表明，在不同效靶比时4种肿瘤细胞表面MICA/B的表达与NK细胞的杀伤敏感性呈正相关，说明MICA/B的表达在NK细胞杀伤肿瘤细胞中发挥着重要作用。

根据MICA/B在肿瘤细胞表面的表达特点，已有研究表明用抗MICA抗体调理的肿瘤细胞负载树突状细胞（dendritic cell，DC），能引起肿瘤抗原特异性 T 细胞的活化［9］；Watson等［10］对 449例直肠结肠癌的研究发现，MICA表达低的患者预后差，MICA可作为预后评估的指标之一。因此，深入研究肿瘤细胞表面MICA/B的表达，会为抗肿瘤免疫提供新的思路。

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