葡萄糖氧化酶-过氧化物酶改良法的建立——血糖测定时间窗口的探讨

朱传江，刘 苹

(中国医学科学院北京协和医学院药物研究所，北京 100050)

1 材料

1.1 动物 Wistar大鼠，♂，体质量240～280 g，购自中国医学科学院动物研究所实验动物中心，动物许可证号:SCXK(京)2005-0013。

1.2 试剂 链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)、过氧化物酶和葡萄糖氧化酶，购自Sigma-Aldrich公司。柠檬酸、柠檬酸三钠、2-甲基苯胺和葡萄糖，购自北京化学试剂公司。草酸钾、三氯醋酸和4-氨基安替吡啉(4-AA)，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.3 仪器 紫外可见分光光度计，UV-2000型，尤尼科(上海)仪器有限公司产品。离心机，TGL-16G型，上海安亭科学仪器厂产品。pH计，Delta 320，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司产品。

2 方法与结果

2.1 溶液配制

2.1.1 柠檬酸-柠檬酸三钠溶液 总体积500 ml。准确称取柠檬酸0.7350 g，柠檬酸三钠13.620 g，加蒸馏水至500 ml，测pH值为6.11(范围在5.4～7.0内即可)。

2.1.2 GOD-POD溶液 总体积200 ml。准确称取4-AA 10 mg，加柠檬酸-柠檬酸三钠溶液199.7 ml，2-甲基苯胺0.05 ml，POD(1 040 IU·ml-1)0.125 ml，GOD(1 040 IU·ml-1)0.125 ml，4℃可保存1 wk，如显淡红色，不宜使用。

2.1.3 葡萄糖标准液 准确称取无水葡萄糖，用蒸馏水配成 3.75、7.5、15、30、60、120、240、480 mg·dl-1不同浓度的标准液，4℃保存，过夜后使用。

2.1.4 STZ溶液 浓度为55 mg·kg-1，用0.05 mol·L-1柠檬酸溶液(pH4.5)现配现用。

徐州境内河网交错，水系复杂。大运河傍城而过，故黄河贯穿东西，河道纵横贯通，水库星罗棋布；以故黄河为界，分沂沭泗、故黄河及濉安河三个水系。历史上徐州以战场、煤场、工厂著名，水资源匮乏，洪涝旱渍灾害频发，“水多、水少、水脏”问题突出。徐州市委、市政府立足市情水情，坚持把生态文明建设融入经济社会发展全过程。2011年市委、市政府明确提出要大力建设生态文明；2012年《徐州市生态市建设规划（2011—2015）》审议通过，确定了水生态文明建设的宏伟蓝图；徐州市“十二五”规划把绿色增长列为“六大发展战略”之一，对水生态文明建设进行了全面部署。

2.2 高血糖模型大鼠制备及血糖测定方法 取Wistar大鼠，腹腔注射新鲜配制的STZ溶液(浓度为55 mg·kg-1，注射体积为5 ml·kg-1)，1 wk后测禁食3 h后的血糖，选取血糖值在180 mg·dl-1以上的模型大鼠用于GOD-POD改良法实验。

自模型大鼠内眦静脉丛取血，置凝集盘(1%草酸钾抗凝)中，取0.06 ml置于预先加有5%三氯醋酸0.36 ml的EP管中，混匀，离心3 000 r·min-1×10 min，取上清液0.1 ml置10 ml试管中(冰上操作)，加入GOD-POD溶液2 ml，混匀。同时设空白对照管和标准样品管，前者以同体积的水代替血样，后者以同体积的系列葡萄糖标准溶液代替血样。各管37℃温浴30 min(显色反应)，然后取出室温下(20～22)℃静置反应一定时间，于550 nm处测OD值，根据标准曲线求出血糖值。

Tab 1 Effects of different wave lengths on the optical density of serial concentrations of glucose

Tab 2Effects of different GOD-POD concentrations on the optical density of serial concentrations of glucose(±s，n=3)

Tab 2Effects of different GOD-POD concentrations on the optical density of serial concentrations of glucose(±s，n=3)

GOD-POD concentration/IU·ml-1 OD/mg·dl-1 30 60 120 240 480 720r b 65 0.033±0.004 0.068±0.004 0.126±0.009 0.264±0.018 0.539±0.037 0.767±0.072 0.999 926.930 130 0.059±0.006 0.124±0.014 0.240±0.025 0.493±0.055 1.024±0.105 1.459±0.153 0.999 485.992 260 0.093±0.006 0.202±0.017 0.394±0.032 0.818±0.064 1.636±0.132 2.216±0.134 0.998 317.210 520 0.132±0.009 0.285±0.017 0.552±0.036 1.157±0.071 2.178±0.093 2.516±0.026 0.982 265.891 1 040 0.159±0.003 0.343±0.012 0.659±0.014 1.369±0.060 2.381±0.043 2.565±0.020 0.966 253.827

2.3 反应条件优化

2.3.1 不同波长对测定结果的影响 使用已知系列浓度的葡萄糖标准溶液及1 040 IU·ml-1GOD-POD溶液，按“2.2”项分别测定波长为550 nm和505 nm的OD值，求出OD值与血糖值的相关系数r，见Tab 1。

由Tab 1可看出波长为550 nm时，葡萄糖浓度在3.75～480 mg·dl-1范围内与OD值对应良好，随着葡萄糖浓度倍增，OD值也大致成倍递增，相关系数(r)达到0.999。而波长为505 nm时，葡萄糖浓度在15～480 mg·dl-1范围内与OD值对应良好，但低段3.75～7.5对应不好，提示用550 nm波长测定灵敏度高于用505 nm。故GOD-POD改良法以及本文以下实验中，测定波长均选用550 nm。

2.3.2 不同GOD-POD浓度对测定结果的影响 在GODPOD法测定样品葡萄糖含量时，酶的量需足够才能使葡萄糖完全氧化，故应对GOD和POD的浓度进行优化。按1∶1比例配制不同浓度的GOD-POD溶液，按“2.2”项测定系列浓度的葡萄糖标准溶液，其中温浴后室温静置时间为90 min。结果见Tab 2。

从 Tab 2 可见，GOD-POD 浓度分别为 65、130、260、520、1 040IU·ml-1时，葡萄糖浓度(30～720 mg·dl-1)与OD值大多对应良好，相关系数(r)为0.966～0.999，提示 GODPOD浓度取65 IU·ml-1或130 IU·ml-1已能满足对葡萄糖的氧化要求，且有较高的斜率(b)值。故下一步实验中，选择GOD-POD浓度为130 IU·ml-1，观察显色后室温放置不同时间(0～300 min)对高血糖模型大鼠血样测定结果的影响。

2.3.3 显色反应稳定时段的选择 取9只STZ诱导的糖尿病模型大鼠，从内眦静脉采血0.06 ml，5%三氯醋酸(0.36 ml)沉淀蛋白后离心取上清液0.15 ml，加入GOD-POD(130 IU·ml-1)溶液3 ml，温浴(37℃)30 min，取出室温放置 0、30、60、90、120、150、180、210、240、270、300 min，并分别在这些时间点测定 OD 值，依次求出0～90、30～120、60～150、90～180、120～210、150～240、180 ～270、210 ～300 min时间段OD均值和CV均值。结果见Tab 3。

Tab 3 Observation of a stable period of time for OD detection(GOD-POD:130 IU·ml-1;±s，n=9)

Tab 3 Observation of a stable period of time for OD detection(GOD-POD:130 IU·ml-1;±s，n=9)

Period of time/min OD CV/%0～90 0.505±0.126 35.1±1.4 30～120 0.636±0.157 23.4±0.9 60～150 0.744±0.183 18.8±0.8 90～180 0.846±0.205 14.3±0.9 120～210 0.934±0.223 11.5±1.0 150～240 1.010±0.238 9.2±0.8 180～270 1.075±0.250 7.3±0.6 210～300 1.129±0.260 5.5±0.6

Tab 3显示当酶浓度为130 IU·ml-1时，CV均值在5.5%以上，随着样品放置时间延长，OD均值逐渐增大，CV均值逐渐减小，5 h内没有相对稳定的测定区间。这提示酶浓度为130 IU·ml-1，虽然相关系数r值达到0.999、斜率(b)值达到486(Tab 2)，酶用量节省，但操作中，由于缺乏显色相对稳定的时段(测定窗口)，结果的准确性和组间可比性难以得到保证。因此，以下实验调整GOD-POD浓度为1 040 IU·ml-1，按上法测定不同时间段(90 min时长)的OD均值和CV均值，并重复3次实验，观察并选择显色稳定时段，结果见Tab 4。

Tab 4数据表明，当GOD-POD浓度为1 040 IU·ml-1时，CV均值从0～90 min时段到90～180 min时段逐渐减小，而从90～180 min时段到210～300 min时段逐渐增大，90～180 min时段最小，3次实验分别为 0.8%、0.9%、0.8%，也就是说这区间颜色变化相对较小，而且有90 min时长，便于完成对较大样本的测定。由此可见，1 040 IU·ml-1的GOD-POD浓度和反应管温浴后室温下放置90 min，并在90～180 min时段(时间窗口)内测定OD值较合适。

2.3.4 GOD-POD比例不同对测定结果的影响 GOD在第1步反应中催化葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢，其特异性很高，只针对β-D葡萄糖。而POD在第2步反应中，作用过氧化氢释放出氧，使4-AA与2-甲基苯胺氧化缩合，生成红色醌类化合物，其特异性较差［5］，故需对二者的比例进行优化。取GOD和POD溶液，浓度均为1 040 IU·ml-1，分别按1∶1、1∶2、2∶1进行配制，按2.2项测定已知浓度的系列葡萄糖标准溶液OD值，并求出r值，结果见Tab 5。

结果显示，GOD和POD分别取1∶1、1∶2和2∶1比例时，测得的OD值和相关系数r值，几无差别，故将GOD和POD的比例选定为1∶1。

Tab 4Observation of a stable period of time for OD detection(GOD-POD:1 040 IU·ml-1;±s，n=9)

Tab 4Observation of a stable period of time for OD detection(GOD-POD:1 040 IU·ml-1;±s，n=9)

ND:not determined

Period of time/minⅠOD CV/%ⅡOD CV/%ⅢOD CV/%0～90 1.735±0.344 9.0±1.7 1.736±0.386 10.9±2.2 1.768±0.353 10.8±2.1 30～120 1.825±0.354 4.3±1.0 1.844±0.397 4.5±1.1 1.876±0.363 4.3±0.9 60～150 1.867±0.358 1.6±0.5 1.892±0.401 1.8±0.8 1.918±0.367 1.6±0.6 90～180 1.877±0.358 0.8±0.3 1.907±0.402 0.9±0.6 1.929±0.368 0.8±0.4 120～210 1.865±0.356 1.6±0.5 1.909±0.402 0.9±0.3 1.921±0.368 1.3±0.4 150～240 1.840±0.354 2.4±0.5 1.897±0.402 1.5±0.5 1.898±0.368 2.1±0.8 180～270 ND ND 1.874±0.401 2.1±0.8 1.867±0.366 2.6±0.8 210～300 1.775±0.346 3.2±0.7 1.844±0.399 2.7±1.0 1.828±0.364 3.1±1.0

Tab 5Effects of the different proportion of GOD to POD on the optical density of serial concentrations of glucose(±s，n=3)

Tab 5Effects of the different proportion of GOD to POD on the optical density of serial concentrations of glucose(±s，n=3)

GOD ∶POD OD/mg·dl-1 30 60 120 240 480r 1∶1 0.151±0.002 0.253±0.002 0.640±0.012 1.218±0.013 2.487±0.012 0.9996 1∶2 0.142±0.003 0.241±0.002 0.600±0.004 1.176±0.047 2.479±0.009 0.9995 2∶1 0.155±0.001 0.260±0.001 0.652±0.005 1.237±0.003 2.510±0.005 0.9996

2.3.5 线性范围 配制葡萄糖系列标准溶液:720，480，240，120，60，30，15，7.5，3.75 mg·dl-1，以 GOD-POD 改良法测定其OD值，每一浓度测定3次，取均值，绘制葡萄糖浓度对OD值的曲线，见Fig 1。

Fig 1 Curve of glucose concentration-optical density

Fig 1显示，GOD-POD改良法在3.75～480 mg·dl-1葡萄糖标准液范围内线性良好，此段线性方程为Y=199.267X-3.043，r值为0.998，能满足血糖实测需求。

3 讨论

通过对血糖测定中一些重要影响因素的优化，我们在林志共等［4］建立的小鼠血糖GOD-POD原法的基础上，建立了大鼠血糖GOD-POD改良法。改良法在GOD和POD的浓度及比例、血糖测定窗口、线性范围等方面都较原法有了较大改进。

GOD-POD浓度和测定窗口选择在原法中，GOD的浓度为30 IU·ml-1，而POD的浓度在文献中没有明确［4］。我们按1∶1考察了GOD和POD从65～1 040 IU·ml-1不同浓度对血糖测定结果的影响。发现GOD和POD的浓度为65 IU·ml-1已能完成对大鼠血样中葡萄糖的氧化，可获得非常好的相关系数r值和斜率b值(Tab 2)。调整GOD和POD的浓度为2∶1或1∶2，对测定的结果影响不大(Tab 5)。至此，GOD和POD的浓度似应选择65 IU·ml-1或130 IU·ml-1以节省酶的用量。但继而进行的显色反应后OD测定时段的选择实验表明，65 IU·ml-1或130 IU·ml-1的GOD和POD浓度并不合适。这是因为显色反应后没有相对稳定的OD测定区间(Tab 3)。

对于一个样本数达到50～100管的血糖测定实验，在显色反应相对稳定的时段(即测定窗口，约需60～90 min)内进行OD测定，才能保证结果的准确性和组间可比性。当GOD和POD的浓度为130 IU·ml-1时，从0～300 min(室温静置时间)OD值一直在增加，时段CV值最小在5%以上，其中90～180 min时段的CV值高达14.3%(Tab 3)，没有出现一个显色反应相对稳定区间以供测定。这可能由于酶量低与底物反应速度达到终点较慢所致。当GOD和POD的浓度为1 040 IU·ml-1时，90～180 min时段的 CV值最小(0.846% ±0.205%，n=3，见 Tab 4)，这是一个时长为90 min的显色相对稳定区间，基本能满足较大样本的OD测定。这时的酶量较大，催化底物较快达到反应终点，因而出现显色相对稳定区间。这点与原法大不相同。原法要求在显色后室温放置60 min内比色完毕［4］。而本研究对高血糖样品测定表明，在GOD和POD的浓度为1 040IU·ml-1时，OD值在0～90 min内的CV高达9%以上(Tab 4)，因此如果在显色后室温放置60 min内进行比色测定，则无法保证结果的准确性和组间可比性。其原因可能在于原法测定的是正常小鼠血糖，而改良法测定的是糖尿病模型大鼠血糖。这提示不同来源的血样，正常的或病理的，其中的葡萄糖含量不同，所需的GOD-POD浓度不同，测定窗口将随之发生变化。这也说明研究针对于不同动物(包括大鼠和小鼠、正常和病理)的血糖测定方法是有必要的。另外，在药理学研究方法的代表性专著［6-7］、相关文献报道以及市售血糖测定试剂盒说明书中，作者尚未见对血糖测定窗口的记述。因此本文对这一窗口的详细探索和确定，为血糖测定方法的完善提供了宝贵的资料。

方法学考查原法显示葡萄糖浓度在5～30 mg·dl-1范围相关系数r值达到0.999。改良法大大拓宽了线性范围，在3.75～480 mg·dl-1范围内线性关系良好，相关系数值达0.998(Fig 1);在3.75～720 mg·dl-1范围内，相关系数值略有降低，为0.966(Tab 2)。该浓度范围基本覆盖了糖尿病模型大鼠的高血糖水平。同时，改良法的血糖最低检测浓度可达3.75 mg·dl-1(Tab 1)，日间变异小于4%，这些说明改良法具有较高的灵敏度和精确度。此外，改良法中模型大鼠血样中的葡萄糖值在5 d内基本稳定，GOD-POD溶液在14 d内稳定可用(4℃，结果未显示)。实测结果表明，改良法能满足糖尿病模型大鼠血糖测定的要求。这无疑将对糖尿病的防治和降糖药物的研发产生积极的作用。

［1］王连明，辛晓敏，刘晓民，等.血糖测定的影响因素研究［J］.中国实验诊断学，2006，10(11):1345-7.

［1］Wang L M，Xin X M，Liu X M，et al.The study of inference factors on glucose determination［J］.Chin J Labor Diagn，2006，10(11):1345-7.

［2］李凤华.葡萄糖氧化酶法与己糖激酶法测定血糖的比较［J］.四川省卫生管理干部学院学报，1994，13(4):18-22.

［2］Li F H.A comparison of GOD-POD method and HK method for blood glucose measurement［J］.J Sichuan Contin Educat Coll MS，1994，13(4):18-22.

［3］国家药典委员会.中华人民共和国药典(2005年版，二部)［S］.北京:化学工业出版社，2005:附录104.

［3］Chinese Pharmacopoeia Commission.Chinese Pharmacopoeia.2005，VolumeⅡ［S］.Beijing:Chemical Industry Press，2005:Appendix 104.

［4］林志共，刘群丽，郭 红，等.用小鼠血糖法测定胰岛素生物效价的探讨-用葡萄糖氧化酶法测定小鼠血糖值［J］.药物分析杂志，1985，5(6):333-5.

［4］Lin Z G，Liu Q L，Guo H，et al.Bioassay of insulin by the estimation of blood suger in mice［J］.Chin J Pharm Analys，1985，5(6):333-5.

［5］周丽萍，姜旭淦，徐 军.葡萄糖脱氢酶法测定血清葡萄糖的方法学评价［J］.江苏大学学报(医学版)，2006，16(4):301-3，316.

［5］Zhou L P ，Jiang X G，Xu J.Evaluation of glucose dehydrogenase method for determination of serum glucose［J］.J Jiangsu Univ(Med Ed)，2006，16(4):301-3，316.

［6］乔凤霞.血糖与血脂测定［M］//张均田主编.现代药理实验方法..北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998:1000-3.

［6］Determination of blood glucose and lipid［M］//Zhang JT，chief editor.ModernMethods for Pharmacological Experiments.Beijing:Joint Press House of BMU＆ PUMC，1998:1000-3.

［7］林志彬.常用血糖测定法［M］//徐叔云，卞如濂，陈修主编.药理实验方法学.第3版.北京:人民卫生出版社，2005:1523-5.

［7］Lin Z B.Regular method for determination of blood glucose［M］//Xu S Y，Bian R L，Chen X，chief editors.Methodology of Pharmacological Experiments.3rd ed.Beijing:People′s Medical Publishing House，2005:1523-5.