地锦草有效部位抗真菌作用及其机制研究

安惠霞，古力娜·达吾提，李治建，斯拉甫·艾白，

地锦草，维吾尔药名为夏塔热其尼(Xiahatereqini)，为大戟科植物地锦Euphorbia humifusa Willd.或斑地锦Euphorbia maculata L.的干燥全草，是中医、维吾尔医常用药材，临床主要用于治疗手癣、体癣、足癣、花斑癣、银屑病［1］。红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)是引起皮肤真菌的主要病原菌，占皮肤癣菌病感染的69.5%，可致手癣、足癣、头癣等，所致癣菌病病程持久，难治愈，易复发［2］。采用透射电镜观察地锦草有效部位对红色毛癣菌超微结构的影响，高效液相色谱法研究地锦草有效部位对真菌细胞膜麦角甾醇生物合成的影响，以研究其抗真菌作用的机制。从天然药物中有效地提取、筛选抗真菌活性部位及其成分，寻找安全性好、抗菌谱广、疗效高的抗真菌药物已成为一个重要的研究方向，并具有广阔的应用开发前景［3-5］。

1 材料与方法

1.1 试验药物 地锦草药材由新疆维吾尔医药研究所药剂室提供，经生药学鉴定为大戟科植物地锦草Euphorbia humifusa Willd。药材醇提取后采用大孔吸附树脂法洗脱得到6个部位，课题组参照美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的《产孢丝状真菌的液基稀释法抗真菌药物敏感性试验方案》(M38-A)［6］，对6个不同部位的抗真菌敏感性进行筛选，得出其中部位6的体外抗真菌活性最为明显，对红色毛癣菌的MIC达到149 mg·L-1，定位有效部位。有效部位参照中国药典一部(附录ⅤA)进行含量测定，总黄酮含量为34 mg·g-1。

特比奈芬(TERB)，纯度99.82%，上海诚优有限公司提供，批号为:20090101。

1.2 试验菌株与培养基 红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)，菌种编号:XYZ T.r 40013，由新疆医科大学真菌与真菌病研究中心菌种保藏库(XYZ)提供，均经过常规的真菌学鉴定，在PDA培养基上4℃保存备用。RPMI 1640培养基(Gibco公司);三氮吗啡啉丙磺酸(MOPS，Amresco公司);

1.3 透射电镜观察地锦草有效部位对红色毛癣菌超微结构的影响 参照NCCLS推荐的M38-A方案［6］，将地锦草有效部位(实验浓度为64 mg·L-1)和红色毛癣菌菌接种液分别以1∶1的比例稀释到终浓度，26℃孵育7 d后，PBS漂洗，体积分数为3的戊二醛固定，体积分数为1的锇酸固定，系列浓度乙醇脱水，丙酮+乙醇脱水，包埋剂包埋，烘烤聚合，超薄切片，染色，日立H-600型透射电镜(TEM)观察。

1.4 高效液相色谱法(HPLC)研究地锦草有效部位对红色毛癣菌麦角甾醇生物合成的影响 药物干预菌丝操作同电镜样品的制备。挑取各孔菌丝，PBS(pH=7.4)洗涤，精密称取各组湿菌0.1 g，置于50 ml圆底烧瓶中，加皂化剂(0.1 g·ml-1KOH的甲醇溶液)15 ml，混匀，80℃水浴皂化90 min。加石油醚(沸程30℃ ～60℃)15 ml提取3次，合并提取液置于60 ml分液漏斗中，加水15 ml洗涤，醚层于60℃水浴挥干，得未皂化脂(nonsaponifiable lipids，NSLs)［7］，未皂化脂用甲醇溶解，定容至 5 ml，0.45 μm微孔滤膜过滤，采用高效液相色谱法(HPLC)测定滤液中麦角甾醇含量。

HPLC色谱条件:色谱柱 Waters symmetry shieldTMRP(4.6 mm ×150 mm，5 μm)，柱温30℃;流动相:甲醇;检测波长:282 nm;流速:1.0 ml·min-1;进样量:20 μl。

1.5 统计学分析 麦角甾醇含量测定结果采用Student′s t-test检验，结果以±s表示。

2 结果

2.1 透射电镜观察地锦草有效部位对红色毛癣菌超微结构的影响 未经药物处理的红色毛癣菌透射电镜下观察，菌丝切面的细胞壁完整、厚薄均匀、质地致密;细胞基质均匀，密度较大，细胞器丰富，胞质内清晰可见细胞核、线粒体、脂滴等(Fig 1A)。

地锦草有效部位作用后，红色毛癣菌的透射电镜观察:当以64 mg·L-1浓度作用后，细胞壁剥脱、破裂，细胞膜皱缩、破裂，细胞外表面有明显高电子致密颗粒聚集，细胞肿胀明显，在细胞内可见较多的泡状结构，已无完整的细胞器结构(Fig 1B)。

Fig 1 SEM results of active component of Euphorbia humifusa and TERB against Trichophyton rubrum.TEM(A，50 000 ×)results of Control Trichophyton rubrum;Active component of Euphorbia humifusa(B，64 mg·L-1，50 000 × );TEM results of active component of Euphorbia humifusa and TRBF(C，0.005 mg·L-1，35 000×)

2.2 HPLC研究地锦草有效部位对红色毛癣菌麦角甾醇生物合成的影响

2.2.1 方法学 将麦角甾醇标准品准确配制成0.93 ～29.75 mg·L-16 个浓度的溶液，进样 20 μl，以色谱峰面积为纵坐标，进样浓度为横坐标进行回归，回归方程为:^Y=39004 X+2422.3，r=0.9998。精密度和稳定性良好，麦角甾醇的平均回收率均大于93%，RSD小于3%。

2.2.2 高效液相色谱图(Fig 2)

2.3 麦角甾醇含量测定 由Tab 1可知，不同浓度地锦草有效部位处理后，红色毛癣菌中麦角甾醇含量与其生长对照菌相比，含量明显降低，差异存在显著性(P＜0.01)，并且有明显的剂量依赖性。

Fig 2 Effect of active component of Euphorbia humifusa on ergosterol biosynthesis of Trichophyton rubrum

Tab 1 Contents of ergosterol in the Trichophyton rubrum mycelium in the groups treated with active component of Euphorbia humifusa of different doses and TERB(±s，n=3)

Tab 1 Contents of ergosterol in the Trichophyton rubrum mycelium in the groups treated with active component of Euphorbia humifusa of different doses and TERB(±s，n=3)

＊＊P＜0.01 vs control group;△△P＜0.01 vs low dose group;##P＜0.01 vs middle dose group

Group Dose/mg·L-1 Ergosterol concentration in NSLs/mg·L -1 Growth control 0 34.84±0.02 Low dose 32 23.42±0.00＊＊Middle dose 64 10.04±0.02＊＊△△High dose 128 5.06±0.05＊＊△△##Positive control 0.0025 15.81±0.04＊＊

3 讨论

麦角甾醇是真菌细胞膜的重要组分［8］，它在确保膜结构的完整性，与膜结合酶的活性，膜的流动性，细胞活力及物质运输等方面起着重要作用，一旦麦角甾醇缺乏，必将引起真菌细胞膜功能异常，甚至发生细胞破裂［9］。麦角甾醇生物合成途径中的几个关键酶是抗真菌药物的作用靶位，对其生物合成的研究将为抗真菌药物的筛选及其作用机制的研究提供重要的理论基础［8，10-13］。

地锦草是中医、维吾尔医常用药材，应用广泛。维吾尔医理论认为，地锦草具有清除异常粘液质、胆汁液及败血、消肿止痒之功能，维吾尔医常用其复方百癣夏塔热治疗手癣、体癣、足癣、花斑癣、银屑病等疾病。本课题组参照 NCCLS推荐的 M38-A方案［6］，筛选出对临床常见的真菌具有很强的抗菌作用的有效部位。透射电镜观察发现，地锦草有效部位作用后真菌细胞壁、细胞膜出现多处破裂，胞内细胞器损伤严重;HPLC结果说明地锦草有效部位主要作用于红色毛癣菌细胞膜麦角甾醇合成通路，抑制麦角甾醇的生物合成，从而使真菌细胞膜破坏，通透性增加，内容物外泄，发挥其抗真菌作用。本研究用中药化学提取分离手段与药理实验密切结合，方法快速、简单，结果可靠，初步完成了地锦草有效部位的筛选，为进一步研究其抗真菌作用机制和分离有效的先导化合物奠定基础。

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