P16INK4a和P14ARF蛋白在喉鳞癌中的表达及临床意义

朱莉 王纾宜 李诗敏

·临床研究·

P16INK4a和P14ARF蛋白在喉鳞癌中的表达及临床意义

朱莉 王纾宜 李诗敏

目的探讨P16INK4a和P14ARF蛋白在喉鳞状细胞癌组织中的表达及其临床意义。方法采用免疫组织化学EnVision法检测71例喉鳞状细胞癌组织中P16INK4a和P14ARF蛋白的表达。结果71例喉鳞状细胞癌标本中，35例(49.3 %)P16INK4a蛋白阴性，29例(40.8 %)P14ARF蛋白阴性，15例(21.1%) P16INK4a和P14ARF蛋白表达均阴性。P16INK4a和P14ARF蛋白阴性间无相关性(Pgt;0.05)。P16INK4a和P14ARF蛋白阴性率均与患者性别、年龄及临床分期无相关性(Pgt;0.05)。P14ARF蛋白在I～II期病例中强阳性占阳性比例为41.7%，在III～IV期中强阳性比例为11.1%。结论P16INK4a和P14ARF在喉鳞状细胞癌发生过程中起重要作用，两种蛋白的失活是各自独立的事件。P14ARF蛋白的缺失发生在喉鳞状细胞癌早期。(中国眼耳鼻喉科杂志，2010，10：218-220)

喉肿瘤；鳞状细胞癌；P16INK4a； P14ARF； 免疫组织化学； 蛋白表达

抑癌基因INK4a-ARF同时编码P16INK4a和P14ARF蛋白，这两个蛋白均为细胞周期调控因子,分别通过cyclin D-CDK4-PRB-E2F和MDM2-P53通路履行调控细胞周期的职责[1]。P16INK4a和P14ARF在喉鳞状细胞癌中频发失活,但迄今尚罕见两者同时在喉鳞状细胞癌中表达情况的报道。本科采用免疫组织化学EnVision方法对71例喉鳞状细胞癌标本中P16INK4a和P14ARF蛋白表达进行检测,探讨二者各自及联合表达阴性的临床意义,为判断喉鳞状细胞癌的预后及选择治疗手段提供依据。

1 资料与方法

1.1 资料 肿瘤标本来自本院1992—1999年经病理证实的71例喉鳞状细胞癌患者，其中男性 68例，女性3 例；年龄31～82岁。根据UICC标准进行TNM临床分期：I期27 例，II期 17例，III期19 例，IV期 8例。肿瘤病理分级：高分化21 例，中分化49 例，低分化1 例。另取30例癌旁正常喉黏膜组织(距癌灶边缘2～3 cm)作为对照组。

1.2 方法 一抗体鼠抗人单克隆抗体P16INK4a购自美国Santa Cruz公司，兔抗人多克隆抗体P14ARF购自美国NeoMarkers公司。免疫组织化学检测采用EnVision方法，二氨基联苯胺显色。操作步骤均按说明书进行。每次实验均设阳性对照(已知阳性切片)和阴性对照。

1.3 结果判定标准 P16INK4a蛋白阳性部位以细胞核为主，P14ARF蛋白阳性部位是细胞核，阳性颗粒呈棕黄色或黄褐色。根据P16INK4a及P14ARF在喉鳞状细胞癌癌组织细胞中的反应强度，半定量划分反应等级：阳性细胞lt;5%为阴性，5%～25%为弱阳性(+)，26%～50%为阳性(++)，≥51%为强阳性(+++)。

1.4 统计学处理 采用SPSS11.0软件进行χ2检验及Spearman相关分析，以Plt;0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 P16INK4a和P14ARF蛋白在喉鳞状细胞癌中的表达 P16INK4a蛋白阳性(见附2页图①)36例，阴性35例,阴性率为49.3%； P14ARF蛋白阳性(见附2页图②)42例, 阴性29例,阴性率为40.8 %。对照组30例癌旁正常喉黏膜组织2种蛋白均呈阳性。喉鳞状细胞癌组织中P16INK4a和P14ARF蛋白阴性率均明显高于对照组(Plt;0.01)。

2.2 P16INK4a和P14ARF蛋白在喉鳞状细胞癌组织中的共表达 P16INK4a和P14ARF蛋白表达共阴性15例, 占21.1% (15/71)； P16INK4a阴性而P14ARF阳性20例，占28.2%(20/71)；P14ARF阴性而P16INK4a蛋白阳性14例, 占19.7 % (14/71)；P16INK4a或P14ARF蛋白单一阴性加共阴性表达占69.0%(49/71)。Spearman相关分析显示，P16INK4a和P14ARF表达阴性相互间差异无统计学意义(P=0.734)。

2.3 P16INK4a和P14ARF在喉鳞状细胞癌组织中的表达与临床病理特征之间的关系 P16INK4a和P14ARF蛋白阴性率在患者性别、年龄、临床分期及病理分级间差异均无统计学意义(Pgt;0.05，见表1)。

表1 喉鳞状细胞癌组织中P16INK4a和P14ARF表达与临床病理特征的关系

2.4 P14ARF蛋白在喉鳞状细胞癌癌细胞中的反应强度与临床分期的关系 P14ARF蛋白在癌旁正常喉黏膜组织表达以弱阳性(+)为主，占阳性例数76.7%(23/30)，强阳性(+++)占6.7%(2/30)，在临床I～II期病例中强阳性(+++)占阳性比例为41.7 %(10/24)，弱阳性(+)占8.3 %(2/24)，在III～IV期病例中强阳性(+++)占阳性比例为11.1 %(2/18)，弱阳性(+)占61.1 %(11/18)。P14ARF蛋白在癌旁正常喉黏膜组织、I～II期病例、III～IV期病例中染色强度不完全一致，组间强阳性率比较差异有统计学意义(Plt;0.05)。

3 讨 论

人类第9号染色体短臂2区1带(9p21) 的INK4a-ARF基因位点有2个启动子，其中一个启动子产生的转录产物由外显子Exon1α、Exon2、Exon3和2个内含子组成，编码P16INK4a蛋白；而另一个启动子产生的转录产物由外显子Exon1β、Exon2、Exon3和2个内含子组成, 编码P14ARF蛋白。两个转录产物阅读框架互不相同[2],因而P16INK4a和P14ARF蛋白通过不同径路(P16INK4a/PRB途径、P14ARF/P53途径)对细胞周期起负调控作用[3-4]。

INK4a-ARF是哺乳动物细胞中的一种重叠编码基因位点, P16INK4a和P14ARF蛋白在功能上的相似与协调性,决定了该基因位点的重要生物学意义[5-6]。近年来已证实P16INK4a和P14ARF蛋白在神经胶质瘤、黑色素瘤、鼻咽癌、乳腺癌、白血病、食管癌、胃癌、胰腺癌等恶性肿瘤中表达频发阴性[7-8]。目前，P16INK4a蛋白异常表达与喉鳞状细胞癌的相关性研究已取得了一定的进展[9-10]。Jares等[11]学者研究发现P16INK4a蛋白及其mRNA表达的失调是喉癌中的频繁事件, 且与基因改变及9p21区域的杂合性丢失有关。但有关P14ARF蛋白的研究报道不多，而且多数集中在体外细胞系培养方面[12-13]，在人类实体瘤特别是喉鳞状细胞癌方面甚为少见。与此同时， P16INK4a和P14ARF蛋白在喉鳞状细胞癌中共表达情况的研究，国内外鲜见报道。

本研究重点探讨了P16INK4a和P14ARF蛋白在喉鳞状细胞癌中的各自及联合表达情况，发现71例喉鳞状细胞癌组织中P16INK4a和P14ARF蛋白阴性率分别为49.3%和40.8 %，对比癌旁正常喉黏膜组织中的表达，差异均有统计学意义；同时，P16INK4a或P14ARF蛋白单一阴性加共阴性比例为69.0%，说明喉鳞状细胞癌组织中P16INK4a和P14ARF蛋白阴性率较高。由此推测，P16INK4a和P14ARF蛋白缺失可能与喉鳞状细胞癌的发生有关。本组喉鳞状细胞癌标本P16INK4a和P14ARF阴性差异无统计学意义(Pgt;0.05),提示喉鳞状细胞癌中P16INK4a和P14ARF蛋白表达是各自独立的事件,这可以从它们具有不同的启动子得到解释。71例喉鳞状细胞癌标本中有15例P16INK4a和P14ARF蛋白同时缺失，这一现象与P16INK4a和P14ARF基因处于同一位点的物理特点有关。P16INK4a和P14ARF蛋白阴性率在患者性别、年龄、临床分期及病理分级间差异均无统计学意义(Pgt;0.05)，提示其临床意义有待进一步扩大样本量来研究证实。P14ARF蛋白在癌旁正常组织表达以弱阳性为主(占阳性例数76.7%)，强阳性仅占6.7%，而在I～II期病例中强阳性占优势(占阳性比例为41.7%)，发展到III～IV期时又以弱阳性为主(占61.1%)，强阳性只占11.1%。P14ARF蛋白这种在肿瘤早期表达增强的现象提示P14ARF基因在肿瘤形成早期发挥更重要的作用，即试图通过其扩增来加强P14ARF/P53途径对细胞周期的调控，以期阻止细胞的恶性增殖。

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(本文编辑 杨美琴)

ExpressionandsignificanceofP16INK4aandP14ARFproteinsinlaryngealsquamouscellcarcinoma

ZHULi,WANGShu-yi,LIShi-min.

DepartmentofPathology,EyeEarNoseandThroatHospital,FudanUniversity,Shanghai200031,China

LI Shi-min,Email:lishimin@163.com

ObjectiveTo study the expression and clinical significance of P16INK4aand P14ARFproteins in laryngeal squamous cell carcinoma.MethodsThe expression of P16INK4aand P14ARFproteins was detected in 71 carcinoma samples by immunohistochemistry (EnVision method).ResultsThe negative expression of P16INK4aand P14ARFwas detected in 35 samples(49.3 %)and 29 samples(40.8 %) respectively. While 15 cases(21.1 %)showed simultaneous loss in both proteins. Rank correlation analysis revealed that there was no correlation between negative expression of P16INK4aand P14ARFproteins in carcinoma(Pgt;0.05). The negative expression rate of P16INK4aor P14ARFwas unrelated to the clinical data including gender, age and clinical stage. The overpositive proportion of all P14ARFpositive cases in stage I to II was 41.7% and 11.1% in stage III to IV.ConclusionsThe aberrance of P16INK4aand P14ARFgene might be associated with the oncogenesis of carcinoma. There was no correlation between negative expression of P16INK4aand P14ARFproteins in carcinoma. Moreover, the loss of P14ARFprotein occurred in the early stage of carcinoma. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2010,10:218-220)

Laryngeal neoplasm; Squamous cell carcinoma; P16INK4a; P14ARF; Immunohistochemistry; Protein expression

复旦大学附属眼耳鼻喉科医院病理科 上海 200031

李诗敏(Email:lishimin@163.com)

2010-01-05)