二球悬铃木叶片离体植株再生

李思，金亮，陈永勤，杨之帆

(湖北大学 生命科学学院，湖北 武汉 430062)

悬铃木为悬铃木科、悬铃木属植物的统称.该属植物大约有10种，原产东南欧及美洲等国家[1].其中，一球悬铃木、二球悬铃木和三球悬铃木生长速度快、主干高大、分枝能力强、树冠广阔，夏季具有很好的遮荫降温效果，并有滞积灰尘、吸收硫化氢、二氧化硫、氯气等有毒气体的作用，同时具有适应性广、生长快、繁殖与栽培比较容易等优点，已作为园林植物广植于世界各地，被称为“行道树之王”.我国引入了这3种悬铃木，并被全国绿化委员会选定为优良骨干园林树种，在全国城乡广为栽培.

但是，一球悬铃木、二球悬铃木和三球悬铃木都有共同的缺陷，即成年植株会大量开花、结果，每年春夏季节形成大量的花粉，同时上年的球果开裂、产生大量的果毛.据统计，一株10生、胸径为10 cm的悬铃木，每年可结200～400个球果，而每个球果均可产生200万～500万根左右的果毛[2].这些漂浮于空中的花粉和果毛容易进入人们的呼吸道，引起部分人群发生过敏反应，引发鼻炎、咽炎、支气管炎症、哮喘病等诸多病症.

为了解决悬铃木果毛的问题，目前人们主要采用修剪控果和化学疏花疏果两种措施.修剪控果就是切锯能旺盛开花结果的枝条以达到显著减少悬铃木的结果量[3-5].该方法工作量大，需要年年操作，而且不能彻底解决果毛的问题；同时，修剪还影响夏季遮荫效果.化学疏花疏果是利用化学药剂(如乙烯利、脱落酸、赤霉素、石硫合剂、碘化钾、三氯醋酸等)在开花期间喷洒或注射于悬铃木上，促进花和幼果萎缩、脱落，从而达到控制悬铃木果毛污染的目的[6-8].化学方法也存在工作量大、成本高、除花除果不彻底等问题，并且化学药剂容易污染环境.

培育无果的品种是解决悬铃木果毛污染问题最好的方法.虽然人们在这方面做了不少努力，但效果甚微[9].植物分子生物学与基因工程技术的发展为解决悬铃木的花粉和果毛引起的问题带来了希望，如雄性不育技术[10]、雌性不育技术[11]和无籽技术[12]均可以防止悬铃木结果，解决果毛污染的问题.我们还研究出了防止植物开花的基因工程技术(待发表)，该技术的应用有望培育出不开花的悬铃木，从而可以彻底解决其花粉和果毛所带来的危害.

众所周知，建立高效的离体再生体系是进行植物基因工程研究的必要前提.为了利用转基因技术对其进行遗传改良，人们对一球悬铃木、二球悬铃木和三球悬铃木的离体再生技术进行研究，发现诱导不定芽的最佳材料为下胚轴[13]和种子苗的真叶[14-16].我们在进行二球悬铃木转基因技术研究时，发现其当年成熟的种子不仅消毒困难，而且萌发率低，难以得到足够的材料进行转基因研究.为此，我们研究了二球悬铃木无菌种子苗所繁殖的植株的叶片离体再生的条件，为利用这些植株的叶片培育转基植株提供参考.

1 材料与方法

1.1材料湖北大学校园内生长健壮的二球悬铃木(PlatanusacerifoliaWilld)大树上当年生球果.

1.2 方法

1.2.1 外植体的处理与消毒 剥离球果中的种子，用自来水冲洗60 min，再用含洗涤液的自来水揉洗10 min，然后用自来水冲洗干净.用滤纸吸干种子表面的水分后，在75%的酒精中浸泡60 s，然后转入加有少量tween20 的3%双氧水中，在摇床(100 r/min)上室温消毒24 h；经无菌水冲洗3遍后，用无菌滤纸吸干种子表面水分，将种子接入萌发培养基上.

1.2.2 种子无菌萌发和实生苗的繁殖 种子无菌萌发的幼苗伸长后，将其切成小段，每段带2～3 片叶，接种在增殖培养基上.待茎段形成的新幼茎长出6～8 片叶时，将新幼茎切成小段，每段带2～3 片叶，接种在增殖培养基上.每25～30 d继代培养一次.

1.2.3 实生苗叶片不定芽的诱导 将在增殖培养基上继代6次所形成的植株上的叶片切成小块(大约0.5 cm × 0.5 cm)、接种到添加有不同种类和不同浓度激素的不定芽诱导培养基上.

为了研究植株继代次数对叶片形成不定芽的影响，分别将繁殖10代、15代和20代的植株的叶片切成小块、接种到添加最佳激素组合的不定芽诱导培养基上.

1.2.4 不定芽生根与移栽 将长1.0 cm以上的不定芽切下，接入不同的生根培养基上.当植株长出3～5条根后，打开瓶塞，在培养室炼苗3 d.然后将植株取出，用自来水清洗后，栽入由泥碳土、河沙和土壤配置的基质中，浇透水，保持80%左右的相对湿度、适当遮荫.

1.3培养基与培养条件本试验所用的基本培养基含大量元素500 mg/L NH4NO3、250 mg/L KNO3、500 mg/L Ca(NO3)2·4H2O、200 mg/L KCl、250 mg/L、MgSO4·7H2O、550 mg/L KH2PO4、MS培养基[17]的微量元素、100 mg/L肌醇、1.0 mg/L维生素B1、1.0 mg/L维生素B6、0.5 mg/L烟酸、2.0 mg/L甘氨酸、20 g/L蔗糖和8.0 g/L琼脂.

种子无菌萌发培养基为基本培养基.种子苗增殖培养基为含0.2 mg/L BA和1.0 g/L活性炭的基本培养基.不定芽诱导培养基为含不同浓度BA或TDZ和NAA或IBA的基本培养基.不定芽生根培养基为含1.0 g/L活性炭和0～2 mg/L IBA的基本培养基.所有培养基的pH值为5.8，培养基在121 ℃消毒15 min.

培养容器为250 mL三角瓶，每瓶盛培养基70 mL.所有材料在培养室中培养.培养室温度(25±1) ℃，光照强度为1 500～2 000 lx，光周期为16 h光照/8 h黑暗.

2 结果与分析

2.1种子无菌萌发和实生苗繁殖消毒后的种子接种到基本培养基上10 d内，大约有20%的种子出现真菌污染.少数种子在培养7 d天后出现膨大，以后出现伸出子叶，并进一步形成幼苗(图1A).在40 d的培养期间，大部分种子均没有萌发(图1A)，萌发率大约为3%.

将幼苗转到新鲜的基本培养基上以后，幼苗继续伸长.当幼苗长至6～8片叶后，将其切成小段，接种到增殖培养基上.5～7 d后，其上的侧芽开始生长，25～30 d后每个茎段的基部形成了不定根，上部形成一个有6～10片叶的新幼茎(图1B).对新幼茎进行切割与培养，可以大量繁殖幼茎.

2.2细胞分裂素和生长素对悬铃木叶片形成不定芽的影响将增殖6代的植株上的叶片切成小块、接种在不同的不定芽诱导培养基上.7 d后，少数比较薄、叶脉细的叶块逐渐变褐，随后死亡，其它的叶块均可存活，那些有较粗叶脉的叶块在叶脉伤口处明显膨大、随后形成愈伤组织，黄绿色或红色；20 d后，一些愈伤组织分化出不定芽.随着培养时间的延长，形成不定芽的外植体逐渐增多，不定芽逐渐伸长(见图1C).

不同细胞分裂素和生长素及其浓度对叶片外植体形成不定芽的影响很大.在60 d的诱导过程中，在1～5 mg/L BA与0.1～0.5 mg/L NAA的各种组合中，大部分外植体可以形成愈伤组织，但几乎不形成不定芽，只有在3 mg/L BA和0.3 mg/L NAA的培养基上有少量外植体(6.7%)分化了不定芽(结果未列出)；然而，当1～5 mg/L BA与0.1～0.5 mg/L IBA组合使用时，则不定芽诱导率显著提高，其中以含3 mg/L BA和0.5 mg/L IBA培养基的效果最好，其不定芽的诱导率最高，为46.7%，不定芽数量最多，平均每个叶块形成0.57个不定芽(表1).

图1 二球悬铃木离体植株再生(A) 种子无菌萌发形成的幼苗；(B)由种子苗繁殖所生成的植株；(C)叶片分化出不定芽；(D)不定芽生根后形成的再生植株；(E)移栽2个月后、生长健壮的再生植株.

激素/(mg/L)BAIBA接种的外植体数/个不定芽诱导率/%平均不定芽数*/个10.1907.80.1010.39010.00.1210.5906.70.0820.19012.20.1320.39023.30.2920.59027.80.3130.19022.20.2730.39034.40.4930.59046.70.5740.19017.70.2240.39036.70.4140.59015.60.1850.1908.90.0950.39014.40.1750.59018.90.24

*平均不定芽数=不定芽总数/外植体数总数,下同.

当0.5 、1.0、3.0 mg/L TDZ与0.1、0.3、0.5 mg/L IBA组合时，外植体很容易形成愈伤组织，并且愈伤组织生长快，红色或黄白色，呈松散的粉末状，但未见不定芽的分化(结果未列出).

表2 二球悬铃木种子苗继代次数对不定芽诱导的影响

2.3实生苗继代次数对叶片形成不定芽的影响分别将第10次、15次和20次继代所形成的植株的叶片切成小块、接种到含3 mg/L BA和0.5 mg/L IBA的不定芽诱导培养基上.60 d后，其不定芽的诱导率分别为44.2%、40.0%和38.3%，平均每个外植体形成不定芽数分别为0.53、0.45和0.47(表2).结合植株增殖6代的结果(表1)，可以看出随着继代次数增加，叶片分化不定芽的能力逐渐下降，但是下降趋势比较缓和，在继代15次和20次时，不定芽的诱导率仍然达到40%左右，平均每个叶块可以形成0.45个不定芽.

2.4不定芽生根与再生植株移栽二球悬铃木的不定芽比较容易生根.在无IBA的培养基上培养7 d后，不定芽开始出现不定根，至20 d时，生根率达到98%，每株平均有3.6条不定根.但培养基中添加1～2 mg/L IBA对不定芽生根有较好的促进作用，不仅生根早、速度快，而且根多，并出现大量侧根(表

表3 IBA对二球悬铃木不定芽生根的影响

3，图1D).经过炼苗后，将再生植株从三角瓶中取出、用自来水清洗.二球悬铃木再生植株的不定根较脆，容易折断，因此，对其操作要小心.在栽入基质后的头10 d中，注意保湿和遮荫，适时浇水，植株明显伸长、并长出1～2片新叶.以后逐渐增加光照、常规栽培管理，60 d后，再生植株生长正常(图1E)，移栽成活率达到92%.

3 讨论

尽管以悬铃木子叶和实生苗真叶为外植体的不定芽诱导和植株再生已有报道[13-16]，但以其实生苗无性繁殖的植株的叶片为外植体的离体再生尚少见报道.本研究比较了细胞分裂素BA或TDZ与生长素NAA或IBA组合对二球悬铃木种子苗增殖植株的叶片分化不定芽的影响.结果表明，BA与NAA组合、TDZ与IBA组合几乎不能诱导二球悬铃木叶片形成不定芽，而BA与IBA组合则效果好，其最佳浓度分别为3 mg/L和0.5 mg/L；在此组合下，繁殖6代和10代的二球悬铃木植株叶片不定芽诱导率分别为47%和44%，与以下胚轴为外植体的诱导效果[13]相当，但繁殖15代和20代后，不定芽诱导率有所下降，分别为40%和38%.

同一球悬铃木和三球悬铃木种子苗的真叶分化不定芽的比率相比，本研究中二球悬铃木种子苗叶片分化不定芽的比率显著偏低.范国强等[14]研究了三球悬铃木种子苗第1至第7片真叶形成不定芽的条件，结果表明最佳的不定芽诱导培养基为含2～4 mg/L BA和0.1 mg/L IBA的WPM培养基，以第4至第7片真叶为外植体效果最好，不定芽诱导率可以达到70%～100%.何晓兰等[15]发现三球悬铃木种子苗的真叶在含2 mg/L BA、0.5 mg/L KT和0.1～0.2 mg/L IBA的WPM培养基上也有很好的不定芽诱导效果，诱导率可达70%以上.Sun等[16]发现，在含5 mg/L BA和 0.1 mg/L IBA的WPM培养基上，20～60 d苗龄的一球悬铃木种子苗叶片不定芽诱导率高达90%.这种差异不仅与植物种类和叶片的生理状态不同有关，也可能与基本培养基不同有关.

本研究结果证明了二球悬铃木种子苗无性增殖15～20代的植株叶片仍然有较高的不定芽形成能力，不定芽诱导率可达40%左右，这对于培育转基因植株来说是足够的.因此，在试验材料不足的情况下，则可以先对二球悬铃木种子苗进行无性扩繁，从而保证有足够的材料用于转基因研究.

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