E.coli酪氨酸转氨酶的纯化与非天然氨基酸的底物特异性检测

陈茹，王行国,何婷，张萍萍

(湖北大学 生命科学学院，湖北 武汉 430062)

芳香族氨基酸转氨酶由tyrB基因编码,其单亚基分子量为45 ku，为二聚体.等电点pI为4.6～4.8.最适反应pH为7.0.主要用于合成苯丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸和亮氨酸[1].非天然氨基酸在工业，食品上应用广泛，它还是许多天然与合成药物的组成成分[2].微生物酶转化法生产非天然氨基酸与传统化学方法相比，具有立体选择性强，原材料易得，反应简单，容易控制，条件温和，操作简便，稳定性好，成本较低，污染少等特点.

我们将酪氨酸转氨酶基因(tyrB)通过表达载体pET23a转入宿主菌E.coliBL21(DE3)，在诱导剂IPTG下大量表达，将破细胞得到的上清蛋白依次通过硫酸铵分级分离、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析后，获得了纯的酪氨酸转氨酶.运用薄层层析技术(TLC)检测到转氨酶的活性，分别以一些非天然氨基酸作为底物，检测对这些非天然氨基酸的底物特异性的高低.为以后构建具有非天然氨基酸底物特异性的酪氨酸转氨酶工程菌打下基础.

1 材料与方法

1.1材料菌种为本实验室构建的大肠杆菌(E.coli)重组菌株BL21(DE3)转pET23a-tyrB.

1.2 方法

1.2.1 酪氨酸转氨酶的诱导表达[3]从-86 ℃冰箱接实验室构建好的重组菌株BL21(DE3)转pET23a-tyrB入已灭菌的含10 μL的100 mg/mL氨苄青霉素10 mL LB液体培养基中，置于摇床37 ℃活化12 h.取5 mL活化好的BL21(DE3)转pET23a-tyrB入已灭菌的500 mL的含500 μL的100 mg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃摇床培养4 h至OD600在0.6～0.9之间，加入250 μL的IPTG，37 ℃诱导12 h.

1.2.2 酪氨酸转氨酶粗酶液的提取[4]将500 mL的菌液离心5 000 r/min,15 min.弃上清，用15 mL,50 mmol/L pH8.5的Tris-HCl缓冲液洗菌，并重复洗一次.用20 mL,50 mmol/L pH8.5的Tris-HCl悬浮菌体,超声波40 W/28 min破细胞.离心8000 r/min,20 min,取上清，用20 mL,50 mmol/L pH8.5的Tris-HCl悬浮备用.

1.2.3 硫酸铵溶液分级分离 为找出分级分离的最佳条件，将上清蛋白依次用20%,30%,40%,50%,60%,65%(NH4)2SO4沉淀，将各浓度沉淀下来的蛋白用SDS-PAGE电泳检测，找到最初沉淀目的蛋白的(NH4)2SO4浓度.下次直接用该浓度前的一个(NH4)2SO4浓度直接去掉杂蛋白，上清蛋白用能沉淀目的蛋白的最大(NH4)2SO4浓度沉淀下来，并用适量的50 mmol /L pH8.5的Tris-HCl悬浮.

1.2.4 透析 将上一步悬浮好的蛋白液装入透析带，加入700 mL，50 mmol/L pH8.5 Tris-HCl透析液和搅拌子的烧杯中，每隔约3 h换一次新透析液，共透析4次.取出透析后的样品，离心12 000 r/min,15 min,取上清备用.

1.2.5 离子交换层析[5]选用Q-sepharose Fast Flow填料装柱，用约4倍柱体积的50 mmol/L pH8.5的Tris-HCl 平衡柱子，流速控制在0.8 mL/min,将上一步处理好的样品上柱， 0～0.5 mol/L的NaCl梯度洗脱并收集，设置每管蛋白的收集时间为4 min.用分光光度计测A280并绘制洗脱图谱以及SDS-PAGE检测.根据检测结果和洗脱图谱，合并目的蛋白峰所在的几管,加(NH4)2SO4至40%的浓度,并在4 ℃保存.下一步上样使用.

1.2.6 疏水层析[6]选用 Butyl Sepharose 4B填料装柱，用约4倍柱体积的含40%(NH4)2SO4的50 mmol/L pH8.5的Tris-HCl平衡柱子,流速为0.8 mL/min.将上一步处理好的样品上疏水柱.选用45%～0%(NH4)2SO4梯度洗脱并收集蛋白，设置每管蛋白的收集时间为4 min.用分光光度计测A280并绘制洗脱图谱以及SDS-PAGE检测.根据检测结果和洗脱图谱，合并目的蛋白峰所在的几管,加(NH4)2SO4至65%的浓度,并在4 ℃保存.下一步上样使用.

1.2.7 凝胶过滤层析[7]选用Sepharose 4 FF填料装柱，用约600 mL的5 mmol/L NaCl的50 mmol/L Tris-HCl pH8.5以平衡柱子，流速为0.8 mL/min，将上一步处理好的样品上柱.加入200 mL的等度洗脱液含5 mmol/L NaCl的50 mmol /L Tris-HCl pH8.5,流速为0.8 mL/min.并收集,利用分光光度计测量每管的A280值，绘制洗脱图谱.用SDS-PAGE检测目的蛋白位置.

1.2.8 薄层层析(TLC)检测转氨酶活性及非天然氨基酸底物特异性[8]展层液按正丁醇∶冰乙酸∶水=4∶1∶3的体积比配制而成，将画好点样位置的硅胶板在装有5 mL展层液的层析缸中预跑，待展层液跑完后，取出硅胶板，于通风橱中晾干烘干.用小枪将样品点在标好的位置，标准样点2 μL，样品点10 μL.向层析缸中加入5 mL展层液，将硅胶板放入，待溶液前沿上升距薄板上沿约1 cm处，取出，晾干.用茚三酮溶液均匀喷雾，置烘箱60 ℃～80 ℃或用吹风机显色5～15 min，即可见各种氨基酸的层析斑点，照相记录保存.

2 结果与讨论

2.1 TyrAT重组菌株粗酶液SDS-PAGE电泳检测结果菌种表达后破细胞，得到的上清和沉淀经SDS-PAGE电泳，如图1可以看出目的蛋白主要集中在上清中.

2.2 TyrAT转氨酶的硫酸铵分级分离结果不同饱和度的硫酸铵沉淀的蛋白电泳结果如图2所示，40%和45%时只有少量目的蛋白沉淀下来，硫酸铵饱和度达到65%时所有蛋白几乎全部沉淀下来，因此确定可用45%硫酸铵沉淀去除一部分杂蛋白,而用65%硫酸铵沉淀TyrAT转氨酶.

2.3 TyrAT转氨酶层析分离分离色谱见图3.

2.4 TyrAT转氨酶纯化后的SDS-PAGE结果将TyrAT转氨酶的粗酶液经硫酸铵分级分离、离子交换层析、疏水层析和凝胶过滤层析后的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳后，结果如图4，经过这4步纯化后，已得到较纯的TyrAT转氨酶.

2.5 TLC检测结果

2.5.1 利用自身底物酪氨酸检测酶活 设3个反应管，每管均加入300 μLα-酮戊二酸、30 μL酪氨酸、PLP，其中反应管1和反应管2另加入60 μL已纯化的TyrAT酶，均反应60 min,反应管1和对照管在37 ℃，反应管2在50 ℃反应.

图1 TyrAT转氨酶的破细胞上清与沉淀M：蛋白质marker；1:破细胞沉淀；2：破细胞上清.

图2 TyrAT转氨酶硫酸氨分级分离M:蛋白质maker；1：65%(NH4)2SO4的沉淀；2：60%(NH4)2SO4的沉淀；3：50%(NH4)2SO4的沉淀；4：45%(NH4)2SO4的沉淀；5：40%(NH4)2SO4的沉淀；6：35%(NH4)2SO4的沉淀.

图3 TyrAT转氨酶层析分离色谱图(a) Q-sepharose Fast Flow阴离子交换层析分离色谱图；(b) Butyl-Sepharose 4B疏水层析分离色谱图； (c) Sepharose 4 FF凝胶过滤层析分离色谱图

在硅胶板上依次点2 μL谷氨酸，2 μL酪氨酸，10 μL对照管反应液、10 μL反应管1反应液、10 μL反应管2反应液.结果显示两反应组均有谷氨酸生成，纯化的转氨酶有活性；对照组无谷氨酸生成，未反应.两个温度下转氨酶活性相差不大.如图5.

图4 TyrAT经4步分离纯化后的SDS-PAGE图M:蛋白质Marker；1:粗酶液；2:经硫酸铵分级分离后的蛋白；3:经离子交换层析后的蛋白；4:经疏水层析后的蛋白；5:经凝胶过滤层析后的蛋白.

图5 以酪氨酸为底物的酶活反应TLC图 1：谷氨酸；2：酪氨酸；3：对照管；4：反应管1；5：反应管2.

2.5.2 非天然氨基酸底物特异性检测 我们将纯化出的TyrAT转氨酶以4种非天然氨基酸为底物，TLC检测转氨反应，即TyrAT转氨酶是否对该非天然氨基酸有底物特异性.设了2个最佳温度37 ℃和50 ℃.反应管1在37 ℃下进行，反应管2在50 ℃下进行.

图6 以4种非天然氨基酸为底物的酶活反应TLC图(a)-1：L-正缬氨酸；(b)-1:L-新戊基甘氨酸；(c)-1:L-叔亮氨酸；(d)-1:D-正亮氨酸；2: 谷氨酸；3：对照管；4：反应管1；5：反应管

TLC结果显示,以L-正缬氨酸为底物，L-正缬氨酸在37 ℃和50 ℃下均无反应；以L-新戊基甘氨酸为底物，L-新戊基甘氨酸在37 ℃和50 ℃下均无反应；以L-叔亮氨酸为底物，L-叔亮氨酸在50 ℃下有反应；以D-正亮氨酸为底物，D-正亮氨酸在37 ℃，50 ℃下均有反应.且50 ℃下效果更好.这为下一步改造酶的性质，采用定向进化的方法改变酪氨酸转氨酶的底物特异性，构建产非天然氨基酸的工程菌株打下了基础.

参考文献：

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