白花龙胆花抗炎作用研究

2010-11-24王洪伦李春婷索有瑞

天然产物研究与开发 2010年2期

关键词：秦艽提物水提物

杨芳,王洪伦,李春婷,索有瑞＊

1中国科学院西北高原生物研究所,西宁 810001;2中国科学院研究生院,北京 100049

白花龙胆花抗炎作用研究

杨芳1,2,王洪伦1,李春婷1,2,索有瑞1＊

1中国科学院西北高原生物研究所,西宁 810001;2中国科学院研究生院,北京 100049

为了研究白花龙胆花的抗炎作用,本文对白花龙胆花水提物和 70%乙醇提取物的抗炎活性进行了试验,并测定了水提物和 70%乙醇提物中龙胆苦苷的含量。试验采用二甲苯所致小鼠急性耳肿胀试验和二甲苯所致小鼠腹部毛细管通透性试验。将昆明种小白鼠分为 7组,分别为空白对照组,白花龙胆花水提物高、中、低剂量组和 70%乙醇提取物高、中、低剂量组,灌胃(ig)给药 14 d后,用二甲苯分别于小鼠右耳及腹部致炎。测定左右耳重量,计算肿胀度及肿胀抑制率,测定吸光值。结果表明:白花龙胆花水提物和乙醇提取物的中、高剂量组对于二甲苯所致的小鼠急性耳肿胀和小鼠腹部毛细管通透性都有显著的抑制作用。从而表明:白花龙胆花具有显著的抗炎疗效。

白花龙胆花;抗炎作用

白花龙胆是龙胆科(Gentianaceae)龙胆属 (Gentiana ToumL.)植物麻花秦艽 (Gentiana stram inea Maxim.)的民间俗称,藏医称“解吉嘎保”[1],是我国重要的常用中藏药材资源之一,已有 2000年的药用历史。麻花秦艽又名西秦艽、大秦艽、左秦艽、左扭根等,民间因其花的颜色为白色,将其称为白花龙胆,作为传统常用中药,历代本草皆有收载。其始载于《神农本草经》,列为中品[2]。根据报道,其根部的主要成份是裂环烯醚萜苷类:龙胆苦苷 (gentiopic roside)[3-5]、当药苦苷 (swerta marin)、当药苷 (s weroside)[6]。白花龙胆的根具有多种药效。如祛风湿、退虚热、舒筋止痛的作用,用于治疗风湿性关节痛、结核病潮热、小儿疳热、黄疸性肝炎、小便不利等症[7]。

《中国药典》2005年版将秦艽、麻花秦艽、粗茎秦艽和小秦艽 4种植物收载为中药秦艽的基原植物,以根入药。但在传统藏药中,麻花秦艽除根外,还以花入药,即白花龙胆花。目前,对于白花龙胆的根的抗炎活性研究已有报道,但对于白花龙胆的地上部分,尤其是传统藏药中使用的白花龙胆花的抗炎活性及其它药理活性未见报道,本文对白花龙胆花水提物和乙醇提取物的抗炎作用分别作了研究。

1 实验材料

1.1 实验样品

白花龙胆花 70%醇提物的制备:本试验选用70%的乙醇作为提取溶剂,称取白花龙胆花 1 kg,粉碎至 2～3 cm长,置于 20 L的烧瓶中,料液比为 1∶10,在 70℃水浴中加热回流提取 3 h,重复两次,提取液浓缩回收乙醇,最终浓缩得干物质 292 g,70%乙醇提取物每克相当于生药 3.4 g。白花龙胆花水提物的制备,以蒸馏水作为提取剂,方法同上,最终浓缩得到干物质 242 g,每克相当于生药 4.1 g。

1.2 实验动物

昆明种小白鼠,普通级,(21±0.3)g,由青海省地方病研究中心提供。

1.3 试剂与仪器

伊文思蓝(青海省高原心脏病研究所提供),二甲苯,丙酮(分析纯),生理盐水,甲醇(色谱纯)。龙胆苦苷标准品购自中国生物制品检定所 (批号: 110770-200510)。

CARY 300 B IO紫外-可见分光光度仪 (美国Varian公司),Sigma 3-18K离心机 (德国 sigma公司),ALC 110.4分析天平 (北京赛普利斯公司), Agilent 1200型高效液相色谱仪 (美国Agilent公司)

2 实验方法

2.1 白花龙胆花水提物和乙醇提取物中的龙胆苦苷含量测定

色谱条件:Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm ×150 mm,5 mm)色谱柱,流动相:甲醇一水 (含0.01%乙酸)体系,在 0～20 min内由 20%甲醇等度洗脱,流速1.0 mL/min,柱温 30℃,压力 400 bar,参照相关文献[3,8],选检测波长 270 nm,进样量 4 mL

对照品溶液制备:精密称取标准品,加甲醇制成0.23 mg/mL溶液,进样量依次为 0.46,0.92,1.84, 3.68,7.36 mg。

样品溶液制备:精密称取醇提物和水提物各0.2 g加甲醇分别定容至 25 mL容量瓶中。

2.2 小鼠毛细管通透性测定

取昆明种小白鼠共 70只,按照体重随机分为 7组,每组 10只,雌雄各半,设空白对照组,白花龙胆花水提物低、中、高三个剂量组,白花龙胆花醇提物低、中、高三个剂量组,灌胃剂量分别为 3.0、1.5、0.8 g/kg,连续灌胃 (ig)给药 14 d,于末次给药前 24 h将小鼠腹部皮肤毛脱去,末次给药后 1 h尾静脉注射由生理盐水配制的 0.5%的伊文思蓝 0.1 mL/10 g,随即于腹部去毛皮肤上滴二甲苯 0.03 mL,20～30 min后,脱颈椎致死,剥下腹部皮肤,将蓝斑剪下,将每块蓝斑剪碎浸入盛有 10 mL丙酮-生理盐水 (3: 7)的具塞试管内,存放于暗处,每日摇匀 3～4次,3 d后 2000 r/min离心 10 min,取上清液于 590 nm处测定吸光值,用丙酮-生理盐水校零。

2.3 小鼠耳肿胀实验

取昆明种小白鼠共 70只,按照体重随机分为 7组,每组 10只,雌雄各半,设空白对照组,白花龙胆花水提物低、中、高三个剂量组,白花龙胆花醇提物低、中、高三个剂量组,灌胃剂量分别为 3、1.5、0.8 g/kg,连续灌胃 (ig.)给药 14 d,末次给药后 1 h,将二甲苯均匀涂抹于小鼠右侧耳壳正反两面,每只0.05 mL,1 h后脱颈椎处死,沿耳廓剪下两耳,于同一部位用打孔器打下耳片(8～9 mm)称重,以两耳重量之差为肿胀度,利用下列公式求出肿胀率及肿胀抑制率。

2.4 数据统计处理

实验数据采用 SPSS13.0统计软件进行方差分析处理。

3 实验结果

3.1 白花龙胆花醇提物和水提物中龙胆苦苷的含量

经标准品浓度系列溶液分析测定,得到标准曲线为 Y=1669.79X+150.70(线性范围为:0.46～7.36 mg,r=0.9997),样品测定后将峰面积带入方程计算得到白花龙胆花醇提物中龙胆苦苷的含量为16.5 mg/g,水提物中龙胆苦苷的含量为 14.2 mg/g。

3.2 白花龙胆花醇提物和水提物对小鼠体重的影响

白花龙胆花醇提物和水提物各剂量组对小鼠体重的影响见表1

表 1 白花龙胆花醇提物和水提物对小鼠体重的影响(±s)Table 1 Effect of ethanol extracts and water extracts ofGentiana stram ineaMaxim’s flower on mice weight(±s)

组别Group体重Weight(g)灌胃前Before ig.第一周Firstweek第二周Second week水提物高剂量组High dosage 21.0±1.60 22.6±1.99 23.8±2.80水提物中剂量组Middle dosage 20.7±1.65 21.5±2.38 23.4±3.43水提物低剂量组Low dosage 21.0±1.49 21.5±1.95 23.9±2.18醇提物高剂量组High dosage 21.1±1.36 21.4±1.78 24.4±2.01醇提物中剂量组Middle dosage 20.7±1.58 21.3±2.41 24.0±2.24醇提物低剂量组Low dosage 21.5±1.47 22.8±2.00 24.4±3.01空白对照组Nor mal control 21.1±1.52 21.9±2.18 23.9±3.00

由表 1可知,小鼠经白花龙胆花的水提物和70%乙醇提取物灌胃后,与空白对照组比较,小鼠体重增长无明显差异。说明在本实验所设计的剂量下,白花龙胆花的水体物和乙醇提取物各剂量组对小鼠的体重没有显著的影响。

3.3 白花龙胆花对小鼠毛细血管通透性的影响。

白花龙胆花水提物和乙醇提取物对二甲苯所引起的小鼠腹部毛细管通透性增大的影响见表 2和表3。由表 2和表 3可知:白花龙胆花水提物和乙醇提取物各剂量组对二甲苯所致的毛细管通透性的增加有较好的抑制作用,且呈剂量效应关系,高剂量组与低剂量组间有显著差异,通过乙醇提取物和水提物的相互比较,可以看出本实验中醇提物的效果要稍好于水提物,但无统计意义。

表 2 白花龙胆花水提物对小鼠毛细管通透性的影响 (±s)Table 2 Effectofwater extractsofGentiana stram ineaMaxim’s flower on capillary penetrate in mice(±s)

注:与空白对照组比较△P<0.01,△△P<0.001;高剂量与低、中剂量组比较,▲P<0.01。Note:△P<0.01,△△P<0.001 vs Normal control group;▲P< 0.01 vs low and middle dosage group.

组别Group动物数(只) Animals剂量(g/kg) Dose吸收度A水提取物高剂量组High dosage 10 3 0.1891±0.0144△△水提取物中剂量组Middle dosage 10 1.5 0.2300±0.0391△水提取物低剂量组Low dosage 10 0.8 0.2592±0.0502空白对照组Normal control 10 0 0.3015±0.0620▲

表 3 白花龙胆花乙醇提取物对小鼠毛细管通透性的影响(±s)Table 3 Effect of ethanol extracts ofGentiana stram ineaMaxim.’s flower on penetrate of capillary in mice(±s)

注:与空白对照组比较△P<0.01,△△P<0.001;高剂量与低、中剂量组比较,▲P<0.01。Note:△P<0.01,△△P<0.001 vs Normal control group;▲P< 0.01 vs low and middle dosage group.

组别Group动物数(只) Animals剂量(g/kg) Dose吸收度A乙醇提取物高剂量组High dosage 10 3 0.1694±0.0504△△▲乙醇提取物中剂量组Middle dosage 10 1.5 0.2207±0.0443△乙醇提取物低剂量组Low dosage 10 0.8 0.2604±0.0564空白对照组Nor mal control 10 0 0.3015±0.0741

3.4 白花龙胆花对小鼠耳肿胀的抑制作用

白花龙胆花水提物和醇提物对二甲苯致小鼠急性耳肿胀实验的影响见表 4、表 5。

表 4 白花龙胆花水提物对小鼠耳肿胀的影响 (±s)Table 4 Effect ofwater extracts ofGentiana stram ineaMaxim.’s flower on ear swell in mice(±s)

注:与空白对照组比较△P<0.01,△△P<0.001;高剂量与低、中剂量组比较,＊P<0.01,▲▲P<0.001Note:△P<0.01,△△P<0.001 vsNormal control group;※P<0.01,▲▲P<0.001vsmiddle and low dosage group

组别Group动物数(只) Animal剂量(g/kg) Dose肿胀度Degree of swell抑制率(%) Bate of swell水提物高剂量组High dosage 10 3 0.4836±0.0961△△▲▲＊ 46.76水提物中剂量组Middle dosage 10 1.5 0.7525±0.0558△ 17.15水提物低剂量组Low dosage 10 0.8 0.8268±0.0693 8.968空白对照组Normal control 10 0 0.9082±0.0699

由表 4、表 5数据可知:白花龙胆花水提物和乙醇提取物对小鼠急性耳肿胀有明显的抑制作用,并且呈显著的剂量效应关系,其中,高剂量组的抑制率分别达到 46.67%和 55.88%。此外,高、中、低三个剂量组间也有显著性差异,高剂量组和低、中剂量组间差异极显著,通过比较,本实验中 70%乙醇提取物的效果也优于水提物,但无统计意义。

表 5 白花龙胆花乙醇提取物对小鼠耳肿胀的影响(±s)Table 5 Effect of ethanol extracts ofGentiana stram ineaMaxim.’s flower on ear swell in mice(±s)

注:与空白对照组比较△P<0.01,△△P<0.001;高剂量与低、中剂量组比较,＊P<0.01,▲▲P<0.001。Note:△P<0.01,△△P<0.001 vsNormal control group;＊P<0.01,▲▲P<0.001vsmiddle and low dosage group.

组别Group动物数(只) Animal剂量(g/kg) Dose肿胀度Degree of swell抑制率(%) Bate of swell醇提物高剂量组High dosage 10 3 0.4007±0.1470△△▲▲＊ 55.88醇提物中剂量组Middle dosage 9 1.5 0.6580±0.1287△△ 27.54醇提物低剂量组Low dosage 10 0.8 0.7985±0.0821△ 12.07空白对照组Normal control 10 0 0.9082±0.0699

4 讨论

毛细管通透性测定是解表类药物抑制早期炎症反应的常用方法,其中腹腔染料渗出法,是较为常用、且效果较好的一种方法,染料伊文思蓝可与血浆蛋白稳固结合,当致炎因子诱导毛细管通透性增加时,在一定范围,染料的漏出量可反映血浆蛋白量。小鼠耳肿胀法也是常用的炎症研究方法。

现已从秦艽的根中提取出了龙胆苦苷、秦艽苷A、谷甾醇和挥发油类等多种成分,并发现其具有抗炎、镇痛、降压、升血糖等作用[8],陈长勋等[9]的研究表明,龙胆苦苷对实验动物有良好的抗炎及镇痛作用。本实验通过两种炎症模型,证明了白花龙胆的地上部分—花也有良好的抗炎疗效,对二甲苯所致的小鼠急性耳肿胀和腹部毛细管通透性均有显著的抑制作用,水提物和乙醇提取物都呈显著的量效关系;并且通过比较可知,醇提物的效果要明显优于水提物;其次,经过 HPLC法测定可知,白花龙胆花醇提物和水提物中龙胆苦苷的含量分别达到了16.5,14.2 mg/g,与动物实验中醇提物效果好于水提物的结果一致,证明了龙胆苦苷的抗炎疗效。目前白花龙胆的药材来源主要以野生为主,中药材以根入药,过度采挖使得秦艽资源锐减,如果能将其地上部分花也加以有效利用,那对于白花龙胆资源的可持续利用有很大的意义。

1 Yang YC(杨永昌).TibetanMedicinal(藏药志).People’s Publishing Company ofQinghai,1991.9-10.

2 Wu PS(吴普述)魏.神农本草经.Commercial Press,1955. 67.

3 Wei X(韦欣),He H(贺宏升),Wang S(王曙).Determination of alkaloids and gentiopicrosidein Radix Gentianae macrophyllae by HPLC.W est China J Phar m Sci(华西药学杂志),2006,21:84-86.

4 SunWJ(孙文基),Shen XH(沈晓红),Gao H(高海)Determination of gentiopicroside in Gentianae.Phar m J Northwest(西北药学杂志),1998,13:43-44.

5 Ma X(马潇),Chen XG(陈兴国),Hu ZD(胡之德).Compare the gentiopicroside in 8 kind Gentianae yield Gansu.J Chin M ed M at(中药材),2003,26(2):85-86.

6 Zhang XL(张西玲),JinL(晋玲),LiuLS(刘丽莎)General research of Gentiana andGentiana stram ineain this decade.Chin J Infor Tradit ChinM ed(中国中医药信息杂志), 2003,10(9):62-63.

7 People’s Republic of China Medicine Politics Administration.Modern Practical Herbal.Beijing:People’s Sanitation Publishing Company,1997.1.

8 Hao XX(晓霞),Yu SX(淑娴),He CL(春林).Optimization of the extraction technology of gentiopicroside fromGentiana m acrophyllaPall by orthogonal experiments.Lishizhen M ed M atM ed Res(时珍国医国药),2007,18:1616-1617.

9 Chen qi(陈奇).Chinese TraditionalMedicine Phar macology Experiment.Cuizhou:People’s Publishing Company of Guizhou,1988.8-16.

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Research on Anti-inflammation Effects of Gentiana stram ineaMax im.’s Flower

YANG Fang1,2,WANG Hong-lun1,L IChun-ting1,2,SUO You-rui1＊1Northwest Institute of Plateau B iology,Chinese Academ y of Sciences,Xining 810001,China;2Graduate University of the Chinese Academ y of Sciences,Beijing 100049,China

To study anti-inflammation effectsofGentiana stram ineaMaxim.’s flower onmice lead by xylene,andwe determined gentiopicroside inGentiana stram ineaMax im.’s flower.We use the method ofmice acute ear swelling test and capillary penetrate of abdomen.The mice were randomly divided into seven groups according to theirweight,the nor mal control group,high,middle,low dosage group of water extracts and 70%ethanol extracts.After mouse were feed for 14 days.The s well of ear and absorption of serous albumen were deter mined.The results showed that no matter water extracts or 70%ethanol extracts,each dosage could obviously restrain the inflammation of mice,and take on prominent quantity and effect relation,and then,two methods all showed the effect ofwater extracts not as effective as 70%ethanol extracts.The result indicated thatGentiana stram ineaMaxim.’s flower have significant anti-inflammation effect.

Gentiana stram ineaMax im.’s Flower;Anti-inflammatory Effects

1001-6880(2010)02-0330-04

2008-06-27 接受日期:2008-11-06

中国科学院“西部之光”人才培养计划

＊通讯作者 Tel:86-971-6143857;E-mail:yrsuo@nwipb.ac.cn

R285.5;Q946.91