5-溴甲基-2(5H)-呋喃酮的生理活性初探

董丽丽,金大成,朴仁哲,金仁君,孙东植,田官荣,李熙峰＊

1长白山生物功能因子省部共建教育部重点实验室延边大学,延吉 133002; 2延边大学农学院,龙井 133400;3延边大学医学部,延吉 133002

5-溴甲基-2(5H)-呋喃酮的生理活性初探

董丽丽1,金大成1,朴仁哲2,金仁君3,孙东植3,田官荣1,李熙峰1＊

1长白山生物功能因子省部共建教育部重点实验室延边大学,延吉 133002;2延边大学农学院,龙井 133400;3延边大学医学部,延吉 133002

本文报道了原白头翁素衍生物 5-溴甲基-2(5H)-呋喃酮的合成和抗癌活性及其抑制农作物病原菌活性的探讨结果,表明在 5～20μg/mL范围内,5-溴甲基-2(5H)-呋喃酮对人肺癌A549细胞株有明显的抑制生长的作用;在 50～200μg/mL范围内,其对玉米大斑病菌等的生长抑制率可达到 95%以上。

白头翁;原白头翁素;5-溴甲基-2(5H)-呋喃酮;肺癌A549细胞株;玉米大斑病菌

白头翁 (Pulsatilla chiensis)是长白山区常见的毛茛科植物,其干燥根作为中药始载于《神农本草经》,性寒、味苦,具有清热解毒,凉血止痢,燥湿杀虫等功效[1],其化学成分的分离、结构确定以及生理活性研究与探讨曾很受人们关注[2]。白头翁的水提取液具有抗肿瘤的作用[3];乙醇提取物具有抗菌活性[4]。最近,朴仁哲等人报导了白头翁提取液对植物的化感作用[5]。前人的研究表明,白头翁内的毛茛甙 (Ranunculin)可发生脱糖而转变成原白头翁素(Protoanemonin),而这原白头翁素易二聚成无活性的白头翁素(Anemonin),其转变过程如下。

早在 1949年,Thimann等报导了原白头翁素可以抑制其他植物生长[6]。孙熊鸣等人用乙酰丙酸为原料合成原白头翁素,经生理活性研究,发现原白头翁素显示卓越的杀虫活性[7]。毛茛甙作为原白头翁素的前体,对于口腔癌 KB和肝癌细胞 Bel-7402显示卓越的抑制活性[8]。Seong cheol Bang等人的研究表明,毛茛甙和原白头翁素对 A-549. N I H3T等癌细胞显示相同的活性[9],根据这一结果,作者提出原白头翁素是毛茛甙的活性因素。

从结构上看,题目化合物是溴原子取代毛茛甙的葡萄糖基产物,也是原白头翁素 5-6位碳碳双键上加成溴化氢的产物,因能在生物体内脱去溴化氢转化成原白头翁素,又是原白头翁素的前体,可显示一定的生物活性。本文报导了其合成和生物活性检验的初步结果,可能的转化过程如下。

1 实验材料

丙二酸 (天津市光复精细化工研究所)、吡啶(天津市大茂化学试剂厂)、丙烯醛 (中国医药集团上海化学试剂公司)、无水硫酸钠 (天津市科密欧化学试剂有限公司)、碳酸氢钠(沈阳市沈新试剂厂)、亚硫酸氢钠(中国医药公司北京采购供应站)、乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷(沈阳力诚试剂厂),以上试剂均为分析纯;Br2、HCl、H2SO4(延吉三福化工试剂公司)为化学纯;水为二次蒸馏水。

肿瘤细胞株:人肺癌 A549细胞株购于南京凯基生物科技发展有限公司,本研究中传代培养;新生小牛血清(Newborn calf Serum):购于北京华美生物工程公司,经 56℃水浴灭活 30 min,-20℃冰柜冻存;MTT(噻唑兰):购于北京华美生物工程公司;胰蛋白酶:购于北京华美生物工程公司。供试菌种:突脐蠕胞属玉米大斑病菌 (Exserohilum turcicum)、弯孢属玉米弯孢叶斑病菌 (Curvularia lunata boed)、半知菌亚门镰刀属黄瓜枯萎病菌 (Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)、半知菌辣椒炭疽病菌 (Colletotrichum gloeosporiodies)。

2 实验部分

2.1 题目化合物的合成

本文中题目化合物是按 Scheme 1所示的路线合成的[10]。

图 1 题目化合物的合成路线Fig.1 Synthetic pathway of the title compound

2.1.1 2,4-戊二烯酸的合成

250 mL四口瓶中,放进 10.4 g(0.1 mol)丙二酸和 8.0 mL(0.1 mol)吡啶,升温至 70℃待丙二酸全溶后,开动磁力搅拌,用缓慢滴加 7.0 mL(0.1 mol)丙烯醛,滴加完后继续保持 70℃温度 4 h。冷却至室温,加入 1:1 HCl 12 mL,再加入 30 mL H2O。用乙酸乙酯萃取 3次,有机层用无水 Na2SO4干燥,蒸去溶剂,得到黄色的针状固体 18.4 g,收率69%。1H NMR(CDCl3,300 MHz):δ5.54～5.70 (m,2H),5.91(d,J=15.4 Hz,1H),6.44～6.56 (m,1H),7.28～7.41(m,1H),12.07(s,1H);13C NMR(CDCl3,75 MHz)δ:121.5,126.7,134.5, 146.9,172.4。

2.1.2 5-溴-4-羟基-2-烯戊酸的合成

1000 mL四口瓶中,加入 18.4 g(0.19 mol)2, 4-戊二烯酸,在搅拌下倒入溶有 80 g(0.95 mol)碳酸氢钠的 600 mL蒸馏水溶解,缓慢滴加 12 mL (0.23 mol)Br2,滴毕继续搅拌约 18 h,用 1:1 H2SO4调至 pH=2,用CH2Cl2萃取 3次,水层加入适量的亚硫酸氢钠,用乙酸乙酯萃取 3次,乙酸乙酯层经浓缩后加入适量蒸馏水,用乙醚萃取 3次,乙醚层用无水Na2SO4干燥,浓缩得到淡黄色油状物 15.5 g,收率 53%。1H NMR(acetone,300 MHz)δ:.51～3.63 (m,2H),4.61～4.62(m,1H),6.14(dd,J=16.0, 1.5 Hz,1H),6.98(dd,J=16.0,5.0 Hz,1H);13C NMR (acetone,75 MHz)δ:36.8,69.8,121.9, 147.6,166.7。

2.1.3 5-溴甲基-2(5H)-呋喃酮的合成

称取25.6 g(0.13 mol)5-溴-4-羟基-2-烯戊酸,加入 750 mL蒸馏水和 52 mL 1:1 HCl溶液,充分溶解后,在光化反应器中用汞灯光照 2 h,用 CH2Cl2萃取 3次。水层继续进行光照,重复上面的步骤三次。合并三次的有机层浓缩得到淡黄色油状物 9.24 g,收率为 40%。1H NMR(CDCl3,300 MHz)δ:3.49 (dd,J=10.6,7.1 Hz,1H),3.69(dd,J=10.6,4.6 Hz,1H),5.28～5.32(m,1H),6.29(d,J=5.5 Hz, 1H),7.56(d,J=5.5 Hz,1H);13C NMR(CDCl3,75 MHz)δ:30.3,80.6,123.5,153.9,171.9。从核磁共振数据看,最后一步得到的确实是目的化合物。

2.2 题目化合物的生物活性

2.2.1 抗癌活性检验

2.2.1.1 药物的配制

5-溴甲基-2(5H)-呋喃酮用少量的吐温-80溶解后再溶解于生理盐水中,使用前在配制成所需要的浓度。

2.2.1.2 细胞培养液配制

RPM IMedium 1640(北京华美生物工程公司产品)10.4 g溶于 1000 mL双蒸水中,加 2.0 g NaHCO3,加入 100 u/mL青霉素,100 u/mL链霉素,用正压除菌后,零下 20℃冰柜冻存,用时溶解后加入10%小牛血清,4℃冰箱保存备用 (肿瘤细胞培养用)。

2.2.1.3 细胞复苏与培养

人肺癌A549细胞株冻存于零下 80℃冰箱中,临用前复苏后做实验。用 RP M I-1640培养液置于37℃,5%CO2浓度及饱和湿度恒温细胞培养箱中培养。细胞呈单层贴壁生长,每 2～3 d传代一次,传代时用 0.25%胰蛋白酶消化 2～3 min,用培养液吹打制成细胞悬液,按所需浓度接种。肺癌细胞传代之生长旺盛,于实验前24 h半量换液,用 4 g/L台盼蓝染色3 min,观察活细胞。本实验所用的细胞活性均在98%以上。

2.2.1.4 实验分组及药物处理

人肺癌A549细胞随机分为 1个对照组和 3个实验组,实验组里分别加 5、10、20μg/mL终浓度的药物,每个小组分别培养 12、24、48、72 h,在 4个时间段里观察细胞的变化。对照组除加等体积的生理盐水代替用药外,其余步骤与用药组完全相同。将对数生长期的细胞按所需浓度接种,待 4 h后细胞完全贴壁,加药物处理,培养至预定时间,进行相应实验。

2.2.1.5 MTT法体外细胞毒活性测定

取对数生长期人肺癌A549细胞以 0.25%胰蛋白酶消化后,制成细胞浓度为 10×105个/mL细胞悬液,接种于96孔细胞培养板上,每孔加0.2 mL细胞悬液,置于 37℃,5%CO2细胞培养箱中培养,待大部分细胞贴壁后,实验组加入不同浓度的药物 20 μL,使其终浓度分别为 5、10、20μg/mL对照组加入20μL生理盐水作为阴性对照,每组重复 3个复孔。培养细胞 12、24、48及 72 h后,每孔加MTT(浓度为5 mg/mL)溶液 20μL,置于 37℃,5%CO2细胞培养箱中培养,连续培养 4 h后弃去全部上清液,每孔加入二甲基亚砜 (DMSO)200μL,轻轻振荡 10 min后,用酶标仪在 490 nm波长下测定每孔的吸光度值(A)值。

2.2.2 农药活性检验

采用琼胶平板法 (PSA培养基),在无菌条件下,取一定量的白头翁衍生物溶液加入到已融化的培养基(灭菌后冷却 45～50℃),稀释浓度分别为25、50、100、200μg/mL,摇匀后趁热倒入直径为 9 cm的培养皿中制成平板,不加药剂为对照组。待平板凝固后接入已培养好的、生长一致的各供试病菌的小菌饼(直径为 6 mm)。每皿一块,每处理重复 3次,于 26℃的恒温培养箱中培养,待对照组病原菌长满整个皿后,用十字交叉法测量供试真菌菌落生长直径。

3 结果与讨论

3.1 题目化合物的抗癌活性

MTT法检测结果表明,题目化合物在体外,在 5～20μg/mL范围内,对人肺癌A549细胞株有明显的抑制生长的作用,且呈现出浓度和时间的依赖性(见表 1),计算公式为:增殖抑制率 (%)=(1-加药孔A值/对照组A值)×100%。

3.2 题目化合物的农药活性

四种供试病原菌都随着药品浓度的不断升高抑制率也不断增加。其中,玉米大斑病菌表现最为明显,在 50μg/mL浓度时抑制率已达到 95%,玉米弯孢叶斑病菌抑制率也达到了 85%,黄瓜枯萎病菌在浓度 50μg/mL时抑制率增加不大,而在浓度为 200 μg/mL时抑制率增加到 76%,辣椒炭疽病菌随药品浓度升高抑制率增加平稳,在最大浓度处理时抑制率达到 62%。从图 1可知玉米大斑病菌对此药剂反映最为敏感,抑制作用最好,其计算公式为:菌落直径 (mm)=测量菌落直径 -6.0;抑制率 (%)= (对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径 × 100%。

表 1 题目化合物对人肺癌A549细胞株的生长抑制作用Table 1 Inhibition of the title compound on hyperplasy ofA549 human lung cancer cells

图 1 题目化合物对四种病原菌的抑制曲线Fig.1 Inhibition curve of the title compound on four pathogeny bacteriums

4 结论

5-溴甲基-2(5H)-呋喃酮作为原白头翁素的衍生物,可以看作是原白头翁素的前体,显示同原白头翁素类似的生物活性。至于在生物体内是否转变成原白头翁素有待于继续研究,我们正在进行持续的研究,相关研究结果将在今后陆续发表。

致谢:本研究得到吉林省科技厅的资助,在此表示感谢。

1 State Administration of Traditional Chinese Medicine“Chinese Herbal Medicine”Editorial Board,Chinese Herbal Medicine,on List(中华本草,上册).Shanghai:Scientific and Technical Publishers,1998.

2 ZhongCB(钟长斌),LiX(李祥).The review for the chemical composition and pharmacological effects ofPulsatilla chiensis.Chin A rch Tradit Chin M ed,2003,21:1338-1339.

3 Cai Y(蔡鹰),Tang Y M(唐永明),Liang BW(梁秉文),et al.The experimental studies anti-tumor effect ofPulsatilla chiensis in vitro.Chin Tradit Herb D rugs,1999,30:441-443.

4 Pan XS(潘新社),Zhang HL(张宏利),Han CX(韩崇选), et al.Status and perspectives on the researches of bioactivity ofPulsatilla chinensis.Acta Agric Boreali-occidentalis Sinica, 2004,13(4):160-164.

5 Piao RZ(朴仁哲),Zhao HY(赵鸿雁),Jin DC(金大成), et al.Studies on allelopathy of extraction solution of pulsatilla chiensis on plant.J Anhui Agric Sci,2007,35:3808-3809.

6 Thimann KV,BonnerWD.Inhibition of plant growth by protoanemonin and coumarin,and its prevention by BAL.Proceed NatAca Sci USA,1949,35:272-276.

7 Sun XM(孙熊鸣),Mao YH(毛羽华).Artifically synthesized of effective elementof ranuneacealplant-protoanemonin and tested of biological activity.J Anhui Univ,1991,1:65-70.

8 Li RZ(李润沼),Ji XJ(籍秀娟).The cytotoxicity and action mechanism of ranunculinin vitro.Acta Phar m Sinica, 1993,28:326.

9 Bang SC,K im Y,AnnBZ.Modified syntheticmethod and cytotoxic activity of ranunculin and protoanemonin.J Phar m Soc Korea,2004,48(2):117-121.

10 Estopa C,Font J,Moreno-ManasM,et al.New synthetic entries toγ-heteromethyl substitu-tedα,β-butenolides.Tetrahedron Lett,1981,22:1467-1470.

The Studies of Biological Activities of 5-Bromomethyl-2(5H)-furanone

DONGLi-li1,J IN Da-cheng1,P IAO Ren-zhe2,J IN Ren-jun3,SUN Dong-zhi3,T IAN Guan-rong1,L IXi-feng1＊1Key Laboratory of O rganism Functional Factors of the ChangbaiM ountain,M inistry of Education,Yanbian University,Yanji 133002,China;2Agricultural College of Yanbian University,Longjing 133400,China;3Health Science Center of Yanbian University,Yanji 133002,China

5-Bromomethyl-2(5H)-furanone was synthesized and its biological activities were tested in this paper.The MTT test showed that 5-bromomethyl-2(5H)-furanone in concentration of 0.25,5,10μg/mL could inhibit the hyperplasy ofA549 human lung cancer cells in a dosage– time-dependentmanner.The growth of Exserohilum turcicum was inhibited completely in concentration of 50-200μg/mL.

Pulsatilla chiensis;protoanemonin;5-bromomethyl-2(5H)-furanone;A549 human lung cancer cells;Exserohilum turcicum

1001-6880(2010)02-0319-04

2008-06-10 接受日期:2008-10-27

吉林省科技厅 2007年项目(20070557)

＊通讯作者 Tel:86-433-2733063;E-mail:xifengli6@yahoo.com.cn

R963;O622.2

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