光皮桦总RNA的提取及ACTIN基因的克隆

2010-11-24童再康黄华宏林二培

浙江林业科技 2010年4期

王钰，童再康，黄华宏，林二培

（浙江农林大学林业与生物技术学院，浙江临安 311300）

光皮桦（Betula luminifera）别名亮叶桦、桦角、花胶树，其材质优良，为淡黄色或淡红褐色，纹理细致，木材坚硬，有“亚白果”之美称，是高级实木家具、高级胶合板和实木地板等的优良材料[1]。同时，光皮桦也是制革、化妆品和食物香料的重要原料，其树皮、木材、叶、芽等富含芳香油脂，可提炼香油和桦焦油；树皮含鞣质，可提取栲胶，做消毒剂，治疗皮肤病或做矿石浮选剂；木屑是提取木醇、醋酸的优良原料[1～2]。近年，因其具有较高的经济价值和广泛的用途，我国学者已针对光皮桦开展了遗传改良和新品种育种等工作[3～5]。而且因其具有生长较快、开花结实早等特性，正在逐渐成为林木分子遗传研究的重要材料[6～7]。

从植物组织中提取高质量的RNA是开展基因克隆、表达分析等分子生物学研究的基础。然而，不同植物的组织由于其成分的差异，其RNA的提取存在不同的难点[8]。本研究以光皮桦为材料，通过比较多种RNA的沉淀方法，建立光皮桦总RNA提取技术体系，并以Actin基因作为内标参照，用RT-PCR和RACE方法克隆光皮桦Actin基因全长以验证总RNA提取技术体系的有效性，为进一步开展光皮桦重要基因克隆、转基因等分子生物学研究提供必要的技术与方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

试验材料为光皮桦嫩叶与嫩枝，于2009年4－5月采集于浙江林学院光皮桦种质资源收集园。样品采集后于液氮速冻，并保存于－70℃超低温冰箱备用。

试验主要仪器有高速冷冻离心机、DYY-12型电泳仪、紫外可见分光光度计（NANO DROP2000）、电子天平（1/1000g）、电热恒温水浴锅、电热鼓风干燥箱、超净工作台等。

1.2 主要试剂与配制

十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）、焦碳酸二乙酯（DEPC）；DNase I；聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、β-巯基乙醇（BME）；LiCl。其中反转录引物和水饱和酚为上海生工产品；其余试剂均为国产分析纯药品。提取中所用的溶液除Tris外，均用0.1% DEPC水处理并高压灭菌，Tris溶液用经高压灭菌的水直接配制；玻璃器皿于180℃烘烤12 h；塑料制品等用0.1% DEPC水37℃浸泡过夜后高压灭菌。

CTAB提取液：2%CTAB，2%PVP，100 mM的Tris-HCl pH8.0，25mM EDTA，2M NaCl，0.5 g/L亚精胺，2%β-巯基乙醇，其中β-巯基乙醇使用前加入。

SSTE 的配制：0.5%SDS，1.0 MNaCl，1.0 mM Tris-HCl，1.0 mM EDTA。

1.3 总RNA的提取方法

参照参考文献[9～11]，并以此为基础加以改进与完善。具体方法如下：将700μL提取液加入到l.5 mL离心管，65℃水浴加热10 min。用液氮冷却研钵，取1 g低温冷冻的叶片，迅速置于研钵中，加入液氮以防止研磨过程中叶片褐化，充分研磨后，立即加入到预热好的提取缓冲液中，并迅速混匀。65℃，水浴20 min后冷却（冰上）至室温，期间不断摇动。加入650μL的氯仿、异戊醇混合液混匀（V氯仿：V异戊醇 = 24：1），12 000 r/min，4℃，离心10 min。小心吸取上清液，加入1/20体积4M KAc pH5.5，1/10体积的预冷无水乙醇，等体积（700 μL）的氯仿：异戊醇（24：1），混匀，12 000 r/min，4℃，离心10 min。小心吸取上清液，加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），混匀，12 000 r/min，4℃，离心10 min。吸取上清液。

1.4 不同沉淀方法

1.4.1 LiCl沉淀法（加KAc）上清液加1/4体积的10M LiCl混匀，4℃沉淀过夜，然后12 000 r/min离心10 min。用枪吸干，用500μL SSTE溶解沉淀，转到1.5 mL离心管，加等体积氯仿：异戊醇（24：1）混匀，12 000r/min，4℃，离心10 min。离心吸取上清液，加两倍体积的无水乙醇，－20℃下沉淀2 h。12 000r/min，4℃，离心20 min。去上清，用75%的乙醇洗两次，超净工作台晾干。用20μL DEPC水溶解沉淀，得到RNA样品。除用于电泳和紫外检测外，其余的RNA用－70℃冰箱保存。

1.4.2 LiCl沉淀法（不加KAc）在提取RNA时不加KAc，其他的相同，沉淀方法同上。

1.4.3 NaAc无水乙醇沉淀法吸取上清液，上清液中加入1/10体积3M NaAc（pH 5.2）和2.5倍体积－20℃预冷的无水乙醇，混匀后－20℃放置2 h以上。4℃，12 000r/min，离心10 min；弃上清，75%乙醇清洗沉淀两次，超净工作台晾干。用20μL DEPC水溶解沉淀，得到RNA样品。除用于电泳和紫外检测外，其余的RNA在－70℃冰箱保存备用。

1.4.4 异丙醇沉淀法吸取上清液，上清液中加入等体积异丙醇，－20℃放置1 h以上。4℃，12 000 r/min，离心10 min；弃上清，75%乙醇清洗沉淀两次，超净工作台晾干。用20μL DEPC处理的水溶解沉淀，得到RNA样品。除用于电泳和紫外检测外，其余的RNA在－70℃冰箱保存备用。

1.5 总RNA的质量检测

对获得的RNA样品分别取5μL进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。RNA样品在紫外可见分光光度计（NANO DROP2000）上检测，直接获得A280/A260和A260/A230的数值。

1.6 Actin基因的克隆

按照逆转录试剂盒（TaKaRa）的说明书进行总RNA的逆转录反应，获得cDNA产物。根据GenBank中各种植物的Actin基因核苷酸序列进行同源性比较，找出高度保守的区段，根据同源性高和简并性低的原则设计一对简并引物，克隆Actin基因片段，然后测序分析，最后根据该片段序列设计特异引物，进行3’和5’RACE克隆Actin基因全长。引物由上海生工合成。Actin基因片段克隆采用RT-PCR扩增，20μL反应体系，2μL cDNA模板，2μL 10×Buffer（含MgCl2），0.8μL dNTPs，0.1μL Taq酶，0.2μL上游引物和0.2μL下游引物，加水至20μ L。反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30s、54℃退火30s、72℃延伸90s，30个循环；最后72℃延伸10 min。RACE根据Clontech试剂盒进行。扩增产物用1.2%的凝胶电泳检测。

2 结果与分析

2.1 不同沉淀方法比较

应用改良CTAB法，在相同的前处理条件下，采用不同的沉淀方法，对获得的总RNA进行了电泳比较。从图1可以看出，LiCl沉淀获取的RNA在电泳图上的条带比较清晰、整齐，RNA完整性较好，几乎没有降解。其中不加 KAc的比加 KAc的亮度稍亮，说明前者的效率更高，且更简单、实用。而用异丙醇沉淀法和 NaAc无水乙醇沉淀法所获取的RNA条带清晰度欠佳，而且含有少量DNA，且在28S和18S带中间有不明显的纵向条带，说明有多糖、多酚类物质污染。

图1 提取的总RNA电泳图Figure1 Electrophoretogram of total RNA

图2 RNA逆转录产物电泳结果Figure2 Electrophoretogram of cDNA

2.2 总RNA的质量检测

对提取所得的RNA样品进行吸光值测定，结果如表1。从表1中可以看出，用LiCl沉淀法所获得RNA样品的A260/A280吸光值在1.8 ～ 2.0，A260/A230大于2.0，表明所提取RNA中蛋白、多酚和多糖等杂质污染较少，纯度较高，符合进一步研究的要求。而用NaAc无水乙醇沉淀法、异丙醇沉淀法所获得RNA的A260/A280和A260/A230的吸光值均与标准值有较大偏差，说明其存在一定量的蛋白质、多糖、多酚等杂质污染。

表1 结果分析Table1 Analysis of total RNA by UV Spectrophotometer

2.3 cDNA的合成及Actin基因的克隆

为了检测LiCl沉淀法获得的总RNA能否用于逆转录、基因克隆等分子生物学研究，取LiCl沉淀法（不加KAc）所得到的总RNA进行逆转录和基因克隆试验。由图2可以看出，逆转录cDNA片段形成一条弥散带，长度在100 ～ 2 000 bp，带型清晰，表明该方法得到的总RNA能够满足逆转录实验的要求。

以上述cDNA产物为模板，用Actin基因的简并性引物进行PCR扩增。扩增产物经1.2%的凝胶电泳检测。由图3可以看出，在760 bp左右处有一条亮带，且其上下无杂带，PCR产物克隆测序后，经序列比对表明为Actin同源基因片段。然后根据该片段设计的特异引物进行3’和5’-RACE实验，克隆Actin基因的3’和5’端（图4）。最后将这些片段的序列进行拼接得到光皮桦Actin基因（Blactin）的全长序列，全长1 651 bp，编码377个氨基酸，序列分析表明Blactin与白桦、杨树、棉花、葡萄等的Actin基因的同源性达到99%，说明Blactin确为Actin同源基因（图5）。

图3 RT-PCR扩增Actin基因片段Figure3 Amplification of Actin gene fragment by RT-PCR

图4 3’和 5’-RACE 扩增 Actin 基因 3’和 5’端Figure4 Amplification of 3’ and 5’-end of Actin by RACE

图5 光皮桦Actin基因序列分析Figure5 Sequence analysis of B.luminifera Actin gene

以上结果说明，用LiCl沉淀法（不加KAc）提取得到的RNA质量较高，可用于后续分子生物学的试验研究。

3 讨论

提取纯度高、完整性好的RNA是开展相关分子生物学实验（如逆转录、文库的构建、基因的扩增与克隆）以及基因功能研究等工作的前提条件。我们的前期研究发现，光皮桦与其它木本植物相似，其嫩叶内含物多样、复杂，特别是多糖和多酚类杂质对RNA的分离和纯化会产生很大干扰作用。因多糖与RNA的理化性质相似，抽提过程中易与RNA形成难溶的胶状物沉淀，或者在溶解后形成黏稠的溶液污染RNA样品，造成产量得率低、纯度不高等问题[12～13]，使之无法用于进一步的分子生物学研究；酚类化合物又极易被氧化而褐化[14]，与RNA不可逆结合，导致产量减少和抑制酶活。因此，能否在总RNA提取过程中有效地去除多糖、多酚、等杂质，是提取高质量木本植物RNA的关键。我们曾尝试采用如Trizol试剂盒法等不同方法提取光皮桦叶总RNA，但都无法在光皮桦嫩叶中提取到纯度较高的RNA，有的甚至根本无法提取到。

在本研究中，我们采用改良CTAB法，通过LiCl沉淀、NaAc无水乙醇沉淀和异丙醇沉淀等不同的沉淀方法来提取光皮桦的总RNA。结果表明，NaAc无水乙醇沉淀法RNA产率较低，电泳后条带不清晰，有拖尾现象，存在DNA污染，且没有完全去除蛋白质、多糖和酚类物质；异丙醇沉淀法也存在同样的问题。LiCl沉淀法中KAc的添加与否对试验结果影响不大，但最后所得的RNA产率和纯度以不加KAc的效果稍好。

为了进一步验证提取的总RNA能否用于后续实验，我们以Actin基因为鉴定的对象，通过逆转录、PCR和基因克隆等实验来进行验证。Actin是一种广泛参与真核细胞生理过程的重要基因，在基因表达调控研究时被广泛用作分子内标[15]。在本研究中，我们以LiCl沉淀法得到的RNA为模板，通过逆转录得到的cDNA片段在电泳后形成一条弥散带，进一步的PCR扩增得到单一的Actin基因片段，最后通过RACE实验得到光皮桦Actin基因的全长序列，序列分析表明该基因与其他植物的Actin基因同源性极高。这些结果说明提取的总RNA可以用于进一步的分子生物学实验。

RNA质量检测、逆转录和基因克隆的结果说明CTAB-LiCl沉淀法（不加KAc）是一种提取光皮桦总RNA的有效方法。

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