胰腺冷冻有效性和安全性的实验研究

邱大卫 牛立志 穆锋 彭祥 周亮 李海波 李蓉蓉 徐克成 倪嘉瓒 蒋灵芝 胡以则 郝卓芳

·论著·

胰腺冷冻有效性和安全性的实验研究

邱大卫 牛立志 穆锋 彭祥 周亮 李海波 李蓉蓉 徐克成 倪嘉瓒 蒋灵芝 胡以则 郝卓芳

目的观察胰腺冷冻前后其血液生化指标和组织变化，为胰腺癌冷冻疗法的开展提供依据。方法将15只正常猪分为深度冷冻组(5头)、浅度冷冻组(5头)、不冷冻组(3头)和正常组(2头)。麻醉后开腹暴露猪胰腺，将氩氦冷冻治疗系统探针插入胰腺，深、浅冷冻组分别采用100%和10%的氩气输出功率，冷冻温度分别为-130～-140℃和-110～120℃，形成直径15～20 mm的冰球，然后输入氦气，复温至10～20℃，维持3 min，重复冷冻-复温一个循环。不冷冻组仅插入探针，正常组仅开腹、关腹。检测实验前后血淀粉酶、IL-6、C反应蛋白(CRP)含量，第7天处死动物取胰腺行光镜及电镜观察。结果胰腺的冷冻部位呈黑褐色坏死区，与未冷冻组织有明确界限；镜下见冷冻中心区及侧中心区有明显组织坏死，超微结构全部被破坏、消失，线粒体断嵴脱颗粒，粗面内质网脱颗粒。13头(86.7%)猪术后血淀粉酶增高，多数在第6天降至正常。5头猪(33.3%)血IL-6轻度增高。各组血清CRP水平均无明显改变。所有实验动物均健康存活直到被处死。结论冷冻对实验动物胰腺组织有明确的致死性消融作用，该疗法安全性良好,无严重并发症。

胰腺肿瘤; 冷冻疗法; 动物实验； 有效性; 安全性

胰腺癌是恶性程度极高的肿瘤，治疗十分困难，预后恶劣[1]。冷冻消融术可作为胰腺癌治疗的良好选择[2-3]。然而，有关冷冻对胰腺组织影响的实验性研究鲜有报道。为此我们选择猪作为实验动物，观察胰腺冷冻前后的临床、血液生化指标和胰腺组织的变化，从而为胰腺癌冷冻疗法的开展提供依据。

材料与方法

一、实验动物及冷冻治疗系统

15头有健康合格证书的西藏小型猪，由南方医科大学动物实验中心提供，体重27～32 kg。平均30 kg。

冷冻治疗系统采用EndocareTM CryoSurgical System (CA, USA)，包括主机和冷冻探针。该系统是根据焦尔定律设计，其原理是高压气体经过狭窄的喷嘴进入探针尖端，压力突然下降，不同的气体在局部产生不同的温度变化。氩气引起温度降低可达-160℃，氦气可使温度升高至67℃。

二、实验分组及冷冻方法

15头猪分为4组。深度冷冻组，5头猪。用速眠新Ⅱ诱导后，以Isoflurane维持全身麻醉，开腹分离胰腺，直视下将直径2 mm的冷冻探针插入胰体。以100%的氩气输出功率激活探针，针尖温度显示为-130～-140℃，待局部形成15～20 mm直径的冰球(约5 min)后停输氩气，改输氦气复温至10～20℃，维持3 min，重复以上冷冻-复温一个循环。冰球形成后超声图像上见到以探针为中心向外逐渐扩大的强回光团，其后有大片无回声区声影，表示冷冻成功(图 1)。于冷冻区中心置一缝线作为标记。拔针后针孔贴以粘有凝血酶的明胶海绵，关腹。浅度冷冻组，5头猪。除以10%的氩气输出功率激活探针，针尖温度显示为-110～-120℃外，余同深度冷冻组。不冷冻组，3头猪。仅将探针插入胰腺体，不予冷冻，维持10 min后，拔针,关腹。正常组，2头猪。仅开腹，关腹。

三、观察项目

1．行为表现：观察15头猪进食、活动等表现。

2．血淀粉酶、IL-6、C反应蛋白(CRP)测定：于实验前当日及实验后1、2、3、4、5、6、7 d采血，分离血清。采用苏木氏法测定淀粉酶水平；采用固相ELISA法测定血IL-6及CRP含量。

3．胰腺病理检查和电镜观察：实验后7 d放血处死实验猪，观察胰腺及其周围组织形态。深、浅冷冻组在冰球中心区、冰球与正常胰腺组织交界(冷冻边缘)区及以上两部位的中点(侧中心区)各取2块组织标本，分别以10%甲醛和2.5%戊二醛固定，送光镜和电镜观察。不冷冻组取离探针不同距离的胰腺组织、正常组取不同部位的胰腺标本行光镜及电镜观察。

图1胰腺冷冻前(左图)、后(右图)超声波监测。圆圈系冷冻靶点

结 果

一、行为表现

15头猪在实验期间进食与活动均无异常，未见出血倾向。

二、血淀粉酶、IL-6、CRP含量变化

15头猪中13头(86.7%)血淀粉酶增高。两冷冻组多于实验后第1天增高，第2～3天达高峰，然后下降，至第6天降至正常(图2)。不冷冻组中1头在实验后第5天淀粉酶轻度增高，第7天尚未恢复正常。正常组2头猪于术后第1天淀粉酶增高，一头于第4天降至正常，另1头第7天仍高水平。

深度冷冻组2头分别于术后第1天、第7天，不冷冻组1头于术后第1天及正常组2头于术后第6天血IL-6轻度增高。不冷冻组的1头于次日降至正常，余4头在第7天仍维持在轻度增高水平。深度冷冻组平均IL-6水平最低，与正常对照组相似，浅度冷冻组和不冷冻组的IL-6水平较高(图3)。各组血清CRP水平在实验前后均无明显改变。

图2 实验前后血清淀粉酶水平测定

图3 实验猪血清IL-6在实验前后改变

三、胰腺组织病理学改变

深度、浅度冷冻组胰腺的冷冻部位与未冷冻组织有明确界限，冷冻中心区及侧中心胰腺均有明显坏死，其他部位无充血、水肿、出血等异常(图4)。深度冷冻组中1头在贴近胰腺冷冻区的结肠壁处有约2 cm×2 cm×3 cm的坏死区,与周围组织广泛粘连，并有少许腹腔渗液。不冷冻组除于插针处隐约可见损伤痕迹外，全胰腺无明显异常。

图4 冷冻后第7天的胰腺

深度及浅度冷冻组中半数标本在坏死区有炎性细胞浸润(图5)。坏死及炎性征象以中心区病变较重，由中心向侧中心区及边缘区依次减轻。8头猪在边缘区出现肉芽组织增生；4头在侧中心区、2头在中心区出现肉芽组织增生。此外，深度冷冻组中3头及浅度冷冻组1头猪有胰导管增生；深度冷冻组中1头在边缘区有血管炎性改变。深度冷冻组与浅度冷冻组的组织坏死程度无显著差别。不冷冻组和正常组胰腺未见明显异常。

四、胰腺组织超微结构的变化

深度冷冻组及浅度冷冻组冷冻中心区的细胞全部坏死，所有超微结构全部被破坏、消失；侧中心区细胞大多数坏死，有极少数残存的细胞核，核膜破裂，细胞器残存，线粒体断嵴脱颗粒，粗面内质网脱颗粒；边缘区多数细胞的细胞膜破裂，可见残存的细胞核，细胞器丰富，有较多的粗面内质网和分泌颗粒(图5)。深度与浅度冷冻组的细胞器破坏程度无显著差别。不冷冻组胰腺组织超微结构正常。

图5正常胰腺(a、e)及冷冻后第7天冷冻中心区(b、f)、侧中心区(c、g)、边缘区(d、h)的病理改变(HE ×10或 ×20)及超微结构改变(×40000)

讨 论

胰腺癌是全世界肿瘤相关性病死的主要原因之一，根治性切除是目前有效的治疗手段。但能接受根治性手术的病例不超过10%～20%，即使行肿瘤切除，手术病死率也高达3%[4-5]。Kovach等[6]在1995年至1999年间给10例不能手术切除胰腺癌行术中治疗冷冻，术后疼痛改善，无一例发生胰腺炎、胰瘘和其他并发症。Korpan[7]采用冷冻治疗胰腺癌患者均呈现良好反应，无治疗相关性并发症或病死。徐克成等[3，8]自2001年起应用超声或CT引导下经皮冷冻治疗局部进展性胰腺癌49例，术后6例(12.2%)发生急性胰腺炎，3例(6.1%)腹腔出血，术后1、3年生存率分别为63.1%和9.5%，中位生存期16.2个月，最长一例迄今已生存52个月。

但是，应用冷冻治疗胰腺癌尚处于“婴儿”阶段，需要从实验和临床进一步观察其有效性和安全性。Korpan[7]用20 mm直径的盘状探头直接对狗胰腺进行冷冻，最低温度为-180℃，持续9 min，作单个冷冻-复温轮回。结果显示冷冻后胰腺组织立即在探头周围形成冰球，界限清楚，直径12 mm；几小时后，冷冻区肿胀，边缘发红，发生无菌性坏死和血栓形成；4周后，冷冻区出现疏松结缔组织，伴大量血管形成；9～12周后，局部出现紧密结缔组织。本实验冷冻温度为-130～-140℃和-110～-120℃，冷冻时间仅5 min，结果显示两种温度对胰腺组织损伤程度无显著差别，提示冷冻治疗胰腺癌可采用低功率、短时间和相对较高温度，这样既可保证有效的冷冻消融，又能减少对胰腺过度的创伤。

胰腺含有丰富的消化酶，胰腺损伤会引起急性胰腺炎、坏死和胰漏，导致严重后果。胰腺组织冷冻是否会引发严重并发症，这是临床上最为关注的问题。本实验检测了实验前后血淀粉酶、IL-6及CRP水平，86.7%的猪在实验后有不同程度的淀粉酶增高, 多数在6 d后降至正常。深度冷冻组IL-6最低，与正常对照组相似，浅度冷冻组和不冷冻组较高；全部4组的血清CRP水平在实验期间均无明显改变；临床观察所有实验猪均无异样；第7天开腹时，两冷冻组胰腺均无急性胰腺炎和胰漏的表现，说明胰腺冷冻是安全的。

为了达到对靶组织完全消融，临床上对肝癌实施治疗时，常将冷冻范围超过肿瘤边缘至少1 cm，即有“1 cm安全边缘”之称[9-11]。但由于胰腺体积小，冷冻时可能难以保证“1 cm安全边缘”。因此对胰腺癌的冷冻是否需超过肿瘤1 cm值得进一步研究。

如同任何手术一样，胰腺冷冻治疗的安全性也与手术操作有密切关系。本实验深度冷冻组有一头猪在贴近胰腺冷冻区的结肠壁有局限性坏死区，显然与冷冻过深有关。因此，在进行冷冻治疗胰腺癌时，特别是在经皮冷冻时，精确定位和恰当冷冻十分重要。

[1] Ducreux M,Boige V,Malka D.Treatment of advanced pancreatic cancer.Semin Oncol,2007,34:S25-S30.

[2] Korpan NN.Cryosurgery in the 21st Century∥Korpan NN.Wien-NewYork:Springer,2001：3-8.

[3] 徐克成, 胡以则，牛立志,等.胰腺癌∥徐克成,牛立志.肿瘤冷冻治疗学.上海:上海科技教育出版社,2007：218-225.

[4] Limongelli P,Khorsandi SE,Pai M,et al.Management of delayed postoperative hemorrhage after pancreaticoduodenectomy:a meta-analysis.Arch Surg,2008,143:1001-1007.

[5] Vin Y,Sima CS,Getrajdman GI, et al. Management and outcomes of postpancreatectomy fistula,leak,and abscess: results of 908 patients resected at a single institution between 2000 and 2005.J Am Coll Surg,2008,207:490-498.

[6] Kovach SJ,Hendrickson RJ,Cappadona CR,et al.Cryoablation of unresectable pancreatic cancer.Surgery,2002,131:463-464.

[7] Korpan NN.Pancreas cryosurgery∥Korpan NN.Basics of Cryosurgery.Wein NewYork:Springer-Verlag，2001:151-154.

[8] Xu KC,Niu LZ,Hu YZ,et al.A pilot study on combination of cryosurgery and (125)iodine seed implantation for treatment of locally advanced pancreatic cancer. World J Gastroenterol,2008,14:1603-1611.

[9] Popken F,Seifert JK,Dutkowski P,et al. Comparison of iceball diameter and temperature distribution achieved with 3-mm accuprobe cryoprobes in porcine and human liver tissue and human colorectal liver metastases in vitro.Cryobiology,2000,40:302-310.

[10] Mala T,Samset E,Aurdal L,et al.Magnetic resonance imaging estimated three dimensional temperature distribution in liver cryolesion:a study of cryolesion characteristics assumed necessary for tumor ablation.Cryobiology,2001,43:268-275.

[11] Seifert JK,Gerharz CD,Mattes F,et al.A Pig model of hepatic cryotherapy. In Vivo temperature distribution during freezing and histopathological changes.Cryobiology,2003,47:214-226.

2009-08-06)

(本文编辑：吕芳萍)

Efficacyandsafetyofpancreasfreezing

QIUDa-wei,NIULi-zhi,MUFeng,PENGXiang,ZHOULiang,LIHai-bo,LIRong-rong,XUKe-cheng,NIJia-zan,JIANGLing-zhi,HUYi-ze，HAOZhuo-fang.

DepartmentofOncology,FudaCancerHospitalofGuangzhou,Guangzhou510300,China

XUKe-cheng,Email:xukc@vip.163.com

ObjectiveTo observe the blood biochemical and histological changes before and after pancreas freezing, to provide evidence for cryosurgery for pancreatic cancer.MethodsFifteen healthy pigs were divided into deep frozen group (n=5), shallow frozen group (n=5), non-frozen group (n=3) and normal group (n=2). After anesthesia and laparotomy, a probe of the Argon-Helium Surgical System was inserted into the pancreas, 100% and 10% argon output power were used in deep and shallow frozen group, respectively; and the temperature were -130～-140℃ and -110～-120℃, respectively; which results in an ice-ball with 15～20 mm in diameter. Then helium gas was inputted to increase the temperature to 10～ 20℃ for three minutes; then the whole process was repeated. A probe was inserted into the pancreas in the non-frozen group only and only laparotomy was performed in non-grozen group normal group and normal group. Serum amylase, IL-6, CRP levels before and after the experiment was determined; the pigs were sacrificed at day 7 and the pancreas was harvested for light microscope and electron microscope examination.ResultsThe frozen pancreatic tissue became pitchy necrosis zone, and it could be distinguished from non-frozen tissue; there were obvious tissue necrosis in the center and para-center of frozen area, and the ultra-structure were destroyed and disappeared, mitochondria degranulation and rough endoplasmic reticulum degranulation were observed. Serum amylase was elevated in 13(86.7%) pigs and most returned to normal at 6th day. Serum IL-6 was slightly elevated in 5 (33.3%) pigs. There was no significant difference among all the groups in term of serum CRP. All the pigs were alive until the time of sacrifice.ConclusionsCryosurgery has affirmative fatal ablative effects on pancreatic tissue, and it is safe with no serious complications.

Pancreas neoplasms; Cryotherapy; Animal experimentation; Efficacy; Safety

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.02.017

510300 广州，广州复大肿瘤医院肿瘤科(邱大卫、牛立志、穆锋、彭祥、周亮、李海波、李蓉蓉、徐克成)；深圳大学生命科学学院(倪嘉瓒、蒋灵芝)；广州医学院第二医院(胡以则、郝卓芳)

徐克成，Email:xukc@vip.163.com