氯磷酸二钠对急性坏死性胰腺炎大鼠肝损伤的影响

张建新 张勇 党胜春 沙鑫 蔡华忠 陈敏 姜德立

·论著·

氯磷酸二钠对急性坏死性胰腺炎大鼠肝损伤的影响

张建新 张勇 党胜春 沙鑫 蔡华忠 陈敏 姜德立

目的探讨氯膦酸二钠对急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠肝损伤的保护作用。方法SD 大鼠48 只，按随机表法分为对照组、ANP组和氯磷酸二钠组。采用胰腺被膜下均匀注射5%牛磺胆酸钠制作ANP模型。利用薄膜法制备包裹氯磷酸二纳的脂质体。ANP组和氯磷酸二纳组于制模后立即经尾静脉分别注射空白脂质体和包裹氯磷酸二钠的脂质体。制模后2、6 h分批处死动物，取血检测血清淀粉酶(AMS)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)及IL-6、IL-12的含量，取肝脏和胰腺组织，观察病理学变化。结果对照组、ANP组和氯磷酸二纳组6 h点的ALT含量分别为(73±11)U/L、(257±33)U/L和(184±29)U/L；AST分别为(190±32)U/L、(590±70)U/L和(430±52)U/L；AMS为(814±80)U/L、(5031±471)U/L和(2843±236)U/L；IL-6为(26.7±5.7)pmol/L、(218.0±4.7)pmol/L和(112.3±8.0)pmol/L；IL-12为(4.2±1.0)pmol/L、(309.5±8.5)pmol/L和(153.7±6.3)pmol/L。ANP组和氯磷酸二纳组上述血清指标均显著高于对照组，而氯磷酸二纳组的含量又较ANP组显著降低(P值均lt;0.01)。氯磷酸二纳组大鼠的胰腺及肝脏病理变化均较ANP组明显减轻。结论静脉给予脂质体包裹的氯磷酸二纳对ANP大鼠的肝损伤具有一定保护作用。

胰腺炎，急性坏死性； 脂质体； 肝损伤； 氯磷酸二钠； 枯否细胞

氯磷酸二钠(clodronate)是一种人工合成的双磷酸酯，它在体内形成具有毒性作用的ATP类似物，从而导致细胞内能量代谢障碍，引起破骨细胞凋亡，进而减轻破骨细胞对骨质的吸收[1]，多用于治疗骨质疏松等引起的骨质改变。Shifrin等[2]应用脂质体包裹的氯磷酸二钠干预急性坏死性胰腺炎(ANP)小鼠，结果胰腺局部及全身的炎症反应明显减轻。本文同样采用脂质体包裹的氯磷酸二钠干预ANP大鼠，观察其对ANP并发的肝损伤的保护作用。

材料和方法

一、脂质体包裹的氯磷酸二纳的制备

参照Van Rooijen等[3]的方法并加以改进。使用500 ml的梨形烧瓶，将 8 mg胆固醇溶解在10 ml含10%磷脂酰胆碱的氯仿中，37℃低真空，逐渐旋转蒸馏除去氯仿，随后用含0.6 mol/L的氯磷酸二钠(上海伟进生物科技有限公司)的PBS液洗脱在烧瓶内壁上的乳白色磷脂膜，室温下通氮气保存2 h，在水浴声波震荡器中震荡3 min，再在室温下保存2 h使脂质体膨胀。使用无菌PBS清洗脂质体 2～3 次，最后用4 ml的PBS悬浮沉淀的脂质体，形成乳白色的胶体溶液。应用紫外分光光度法测定脂质体中氯磷酸二钠的浓度及包封率，4 ml悬液大约含有 20 mg的氯磷酸二钠，包封率约为6%。同法制备不含氯磷酸二纳的脂质体。

二、实验动物及分组

大鼠48只，体重350～400 g，清洁级，由江苏大学动物中心提供。随机分为对照组、ANP组和氯磷酸二钠组。采用胰腺被膜下均匀注射5%牛磺胆酸钠2 ml/kg体重(Sigma公司)制备ANP模型。氯磷酸二纳组于造模后尾静脉注射含氯磷酸二钠的脂质体(4 ml/kg体重)；ANP组注射等量空白脂质体；对照组开腹后胰腺包膜下均匀注射等量生理盐水。

三、血AMS、ALT、AST及IL-6、IL-12含量测定

制模后2、6 h分批处死动物，取血分离血清，自动生化分析仪测定血清AMS、ALT和AST含量。采用ELISA试剂盒(美国Invitrogen公司)测定血清IL-6、IL-12含量，严格按照说明书操作。

四、胰腺及肝脏组织形态学观察

取6 h组胰腺头部标本及肝脏右外叶，常规行病理学检查。

五、统计学处理

结 果

一、大鼠血清AMS、ALT、AST及IL-6、IL-12的变化

ANP组和氯磷酸二纳组血清AMS、ALT、AST水平和IL-6、IL-12含量均显著高于对照组(P值均lt;0.01)，而氯磷酸二纳组的含量又较ANP组显著降低(P值均lt;0.01，表1)。

二、胰腺病理形态改变

对照组胰腺大体未见明显改变；镜下胰腺结构良好 (图左1a)。ANP组6 h可见腹腔内血性腹水，胰腺充血水肿、出血、坏死；镜下见胰腺坏死，大量炎性细胞浸润 (图左1b)。氯磷酸二纳组胰腺病变较ANP组明显减轻(图左1c)。

三、肝脏病理形态改变

对照组大鼠肝脏色泽鲜红；光镜下肝小叶、汇管区未见明显变化(图右1a)。ANP组6 h见肝脏充血肿胀；镜下见肝细胞凝固性坏死及脂肪变性，肝小叶汇管区内炎性细胞浸润 (图右1b)。氯磷酸二纳组上述变化较ANP组有所减轻(图右1c)。

讨 论

肝脏是人体最大的巨噬细胞储库，在重症急性胰腺炎(SAP)全身反应中的作用是比较独特的。肝枯否(kupffer)细胞占整个集体单核巨噬细胞的50%，固定巨噬细胞群的80%～90%，是产生炎性细胞因子的主要效应细胞。研究证实，枯否细胞产生的IL-1β、IL-6、TNF-α等细胞因子是导致肝细胞损伤和肝脏功能障碍的直接原因[4-5]。阻止肝巨噬细胞IL-1β、IL-6、TNF-α的产生可以减轻肝的损害[6]。

表1 各组大鼠血清AMS、ALT、AST水平及IL-6、IL-12含量比较

注：与对照组比较，aPlt;0.01；与ANP组比较，bPlt;0.01

图1(左列)对照组(a)、ANP组(b)和氯磷酸二纳组(c)的胰腺病理改变；(右列)对照组(a)、ANP组(b)和氯磷酸二纳组(c)的肝脏病理改变(HE ×20)

自上世纪60年代，脂质体就作为药物载体开始应用。近年来随着生物技术的发展，脂质体作为药物载体的研究越来越受到人们的重视。由于脂质体具有类似细胞膜的结构，进入人体以后主要被内皮网状系统吞噬而激活机体的自身免疫功能，并改变被包封药物的体内分布，使药物主要在肝、脾、 肺、骨骼等组织器官中蓄积[7]。Van Rooijen等[8]报道，静脉内注射氯磷酸二纳脂质体可以被巨噬细胞吞噬，其磷脂酶破坏脂质体的磷脂双分子层，使药物在细胞内释放，从而诱导巨噬细胞的凋亡。本实验结果显示，给予脂质体包裹的氯磷酸二钠能显著降低ANP大鼠血中ALT、AST、AMS和IL-6、IL-12的含量，减轻胰腺及肝脏病损程度，说明其对ANP合并的肝损伤具有一定的保护作用，为临床SAP的治疗提供了一种新的思路和方法。

[1] Frith JC，Mönkkönen J，Blackburn GM，et al.Clodronate and liposome-encapsulated clodronate are metabolized to a toxic ATP analog，adenosine 5′-(beta，gamma-dichloromethylene) triphosphate，by mammalian cells in vitro.J Bone Miner Res，1997，12:1358-1367.

[2] Shifrin AL，Chirmule N，Zhang Y，et al.Macrophage ablation attenuates adenoviral vector-induced pancreatitis.Surgery，2005，137:545-551.

[3] Van Rooijen N，van Kesteren-Hendrikx E."In vivo" depletion of macrophages by liposome-mediated "suicide" .Methods Enzymol，2003，373:3-16.

[4] Liu HB，Cui NQ，Li DH，et al.Role of Kupffer cells in acute hemorrhagic necrotizing pancreaatitis-associated lung injury of rats.World J Gastroenterol，2006，12:403-407.

[5] Pastor CM，Vonlaufen A，Georgi F，et al.Neutrophil depletion-but not prevention of kupffer cell activation-decreases the severity of cerulein-induced acute pancreatitis.World J Gastroenterol，2006，12: 1219-1224.

[6] Yang J，Denham W，Carter G，et al.Macrophage pacification reduces rodent pancreatitis-induced hepatocellular injury through down-regulation of hepatic tumor necrosis factor alpha and interleukin-1beta.Hepatology，1998，28: 1282-1288.

[7] Van Rooijen N，Sanders A.Liposome mediated depletion of macrophages:mechanism of action， preparation of liposomes and applications．J Immunol Methds，1994，174:83-93.

[8] van Rooijen N，Sanders A，van den Berg TK.Apoptosis of macrophages induced by liposome-mediated intracellular delivery of clodronate and propamidine.J Immunol Methods,1996，193:93-99.

2009-07-13)

(本文编辑：吕芳萍)

Protectiveeffectsoflipsomalclodronateonhepaticinjuryinratswithacutenecrotizingpancreatitis

ZHANGJian-xin，ZHANGYong，DANGSheng-chun，SHAXin，CAIHua-zhong，CHENMin，JIANGDe-li.

DepartmentofGeneralSurgery，AffiliatedHospital,JiangsuUniversity，Zhenjiang212001,China

ZHANGJian-xin，Email:dscgu@163.com

ObjectiveTo investigate the protective effect of lipsomal clodronate against hepatic injury in rats with acute necrotizing pancreatitis (ANP).Methods48 SD rats were randomly divided into control group, ANP group and lipsomal clodronate group, respectively. The models of ANP were established by injection of sodium taurocholate into the pancreatic capsule. Lipsomal clodronate was prepared by means of thin film. Blank liposomes and clodronate-containing liposomes was injected via caudal vein in ANP group and lipsomal clodronate group, respectively. The rats were sacrificed at 2, 6 h after ANP induction, the serum levels of ALT, AST and AMS, IL-6，IL-12 were measured, and pathologic changes of liver and pancreas were observed.ResultsAt 6 h, serum level of ALT was (73±11)U/L, (257±33)U/L and (184±29)U/L in control group, ANP group and lipsomal clodronate group, respectively; serum levels of AST were (190±32)U/L, (590±70)U/L and (430±52)U/L, respectively; serum levels of AMS were (814±80)U/L, (5031±471)U/L and (2843±236)U/L, respectively, serum levels of IL-6 were (26.7±5.7)pmol/L, (218.0±4.7)pmol/L and (112.3±8.0)pmol/L, respectively; serum levels of IL-12 were (4.2±1.0)pmol/L, (309.5±8.5)pmol/L and (153.7±6.3) pmol/L. The values in ANP group and lipsomal clodronate group were significantly higher than those in control group, while the values in lipsomal clodronate group were significantly lower than those in ANP group (Plt;0.01). Pathologic changes of liver and pancreas were significantly attenuated in lipsomal clodronate group.ConclusionsIntravenous liposomal clodronate could exert protective effects on the hepatic injury in rats with ANP.

Pancreatitis,acute necrotizing； Liposomes； Hepatic injury； Clodronate; Kupffer cells

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.02.009

国家自然科学基金资助项目(30772117)；江苏省自然科学基金资助项目(BK2007096)；镇江市社会发展基金项目(SH2008036)

212001 镇江，江苏省镇江市江苏大学附属医院普外科(张建新、张勇、党胜春、沙鑫、蔡华忠)；江苏大学化学化工学院(陈敏、姜德立)

张建新，Email:zhangjx@ujs.edu.cn