羟乙基淀粉(130/0.4)对急性坏死性胰腺炎大鼠脑毛细血管渗漏的影响

陈德招 黄鹤光

羟乙基淀粉(130/0.4)对急性坏死性胰腺炎大鼠脑毛细血管渗漏的影响

陈德招 黄鹤光

重症急性胰腺炎(SAP)常发生严重的毛细血管渗漏综合征(capillary leak syndrome，CLS)，血管内水分迅速进入组织间隙，引起全身水肿及有效循环血量下降，重要脏器灌注不足。SAP并发的胰性脑病(pancreatic encephalopathy，PE)是SAP病程中出现的严重并发症，其发病机制与脑的毛细血管渗漏密切相关。水通道蛋白4(AQP4)是脑组织内最重要的水通道蛋白，本研究探讨AQP4在急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠脑毛细血管渗漏中的作用。

一、材料和方法

1．实验动物及分组：雄性SD大鼠48只，购自中国科学院上海实验动物中心，体重200～250 g。按完全随机法分为假手术组、ANP组和羟乙基淀粉(hydroxyethyl starch，HES)治疗组。采用胰胆管逆行注射5%牛磺胆酸钠(Sigma公司)1.0 ml/kg体重制备ANP模型[1]。HES组在建模后即经右侧股静脉微注泵注入HES 130/0.4 15 ml/kg体重。假手术组仅轻轻翻动十二指肠及胰腺。各组于术后6、24 h经下腔静脉采血2 ml，并切取胰腺、脑组织。

2．血清TNF-α检测：采用ELISA法，按试剂盒(购自武汉博士德生物工程有限公司)说明书操作。

3．脑组织含水量测定：取脑组织右侧全部额叶，滤纸吸干表面水分，用分析天枰称湿重后置110℃烘烤24 h至恒重，再称干重。脑组织水含量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。

4．胰腺、脑组织病理学检查：按常规操作。

5．AQP4 mRNA检测：按试剂盒(Fermentas公司)说明书抽提脑组织总mRNA，采用RT-PCR法检测AQP4 mRNA的表达。引物序列：AQP4上游5′-GAAAGATCAGCATCGCCAAGTC-3′，下游5′-GCAACGGAACCAGTAACATCAG-3′，扩增片段247 bp；内参β-actin上游5′-TATCGGCAATGAGCGGTTCC-3′,下游5′-AGCACTGTGTTGGCATAGAGG-3′，扩增片段150 bp。反应条件：94℃ 3 min；94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 45 s，35个循环；72℃延伸10 min。PCR产物电泳后扫描，以AQP4与β-actin扩增片段的灰度值之比作为AQP4 mRNA相对表达量。

6．AQP4蛋白检测：应用免疫组织化学方法。按PV-6001通用型二步法检测试剂盒(北京中杉金桥公司)说明书操作。高倍镜下随机选取5个视野，应用十三点评分法计算阳性细胞数。无阳性细胞为0分；阳性细胞<10%为1分；10%～50%为2分；>50%～80%为3分；>80%为4分。染色强度按阴性、弱、中、强染色分别评为0～3分。两分值相乘作为AQP4蛋白表达值，取5个视野的均数。

二、结果

1．血清TNF-α含量变化：ANP组6、24 h血清TNF-α分别为(97.14±6.70)pmol/ml和(148.49±24.77)pmol/ml；HES组为(78.29±4.77)pmol/ml和(112.50±7.11)pmol/ml；假手术组为(35.84±11.91)pmol/ml和(38.58±12.22)pmol/ml。ANP组和HFS组均显著高于假手术组，HES组又较ANP组显著降低(P值均<0.05)。

2．胰腺、脑组织病理学改变：假手术组胰腺组织无明显改变(图1a)。ANP组胰腺肿大，大片凝固性坏死、出血，大量炎性细胞浸润(图1b)。HES组胰腺坏死和炎细胞浸润程度较ANP组减轻。

图1 对照组(a)和ANP组(b)胰腺的病理改变(HE ×400)

假手术组脑组织无明显改变(图2a)。ANP组脑组织毛细血管扩张、充血、脑组织疏松、神经细胞水肿(图2b)。HES组脑组织毛细血管扩张充血程度较ANP组减轻(图2c)。

图2对照组(a)、ANP组(b)及HES治疗组(c)脑组织病理改变(HE ×400)

3．脑组织含水率变化：ANP组6、24 h脑组织含水率分别为(79.72±0.62)%、(80.44±0.54)%，显著高于假手术组的(76.98±0.57)%、(77.30±0.83)%(P<0.05)；HES组分别为(78.13±0.25)%和(78.59±0.42)%，较ANP组显著降低(P<0.05)。

4．AQP4 mRNA和蛋白表达变化：ANP组6、24 h脑组织AQP4 mRNA表达量为0.7735±0.0243、0.8142±0.0168，显著高于假手术组的0.5083±0.0466和0.5480±0.0488(P<0.05)；HES组分别为0.6767±0.0255、0.7181±0.0188，高于假手术组，但显著低于ANP组(P<0.05)。

ANP组6、12 h脑组织AQP4蛋白表达量分别为6.88±1.89、7.50±1.60，显著高于假手术组的3.25±1.04和3.50±0.93(P<0.05)；HES组分别为4.63±2.07、5.63±1.69，高于假手术组，但显著低于ANP组(P<0.05)。

讨论研究显示[2-3]，SAP继发的脑组织损伤与炎症因子TNF-α和IL-1引起脑的毛细血管内皮损伤密切相关。本实验ANP组血清TNF-α、脑组织含水率较假手术组显著升高，提示其发生机制与ANP时发生全身炎性反应综合征(SIRS)关系密切。

AQP4是中枢神经系统中分布较广泛的水通道蛋白，主要表达于脑内毛细血管的内皮细胞、星形胶质细胞和室管膜

细胞内，尤其富集于与毛细血管和软脑膜直接接触的胶质细胞中。这种分布特点提示AQP4在维持大脑水平衡中起重要作用。Manley等[4]报道，AQP4在缺氧、缺血、创伤及肿瘤性脑水肿情况下表达增强。Marios等[5]报道，AQP4可促进脑水肿形成，与血脑屏障(BBB)的完整性相关。Tomás等[6]报道，随着BBB的破坏，AQP4的表达上调，提示BBB破坏可能是导致AQP4表达增加的原因。

本实验结果显示HES组血清TNF-α、脑含水率、AQP4 mRNA及蛋白表达量均较ANP组显著下降，推测羟乙基淀粉可能通过其抗炎作用抑制TNF-α的释放，抑制内皮细胞活化从而阻断白细胞的黏附及迁移，减轻其对脑血管内皮细胞及血脑屏障的损伤，间接下调脑的毛细血管内皮的AQP4表达，缓解脑毛细血管渗漏的作用。

[1] 杨波，黄鹤光，陈大良，等.逆行性胰胆管注射法制作重症急性胰腺炎大鼠模型.福建医科大学学报，2002，36:71-72.

[2] Norman J.The role of cytokines the pathogenesis of acute pancreatitis．Am J Surg，1998，175：76-83．

[3] Yang YL，Li JP，Li KZ，et al.Tumor necrosis factor alpha antibody prevents brain damage of rats with acute necrotizing pancreatitis. World J Gastroenterol，2O04，10：2898-2900．

[4] Manley GT，Fujimura M，Ma T，et al．Aquaporin-4 deletion in mice reduces brain edema after acute water introxication and ischemic stroke．Nat Med，2000，6：159-163．

[5] Marios C，Papadopoulos，Geoffrey T，et al.Aquaporin-4 facilitates reabsorption of excess fluid in vasogenic brain edema．Faseb J，2004，18：1291-1293．

[6] Tomás-Camardiel M，Venero JL，Herrera AJ，et al.Blood-brain barrier disruption highly induce aquaporin-4 mRNA and protein in perivascular and parenchymal astrocytes: protective effect by estradiol treatment in overienctomized animals.J Neurosci Res，2005，80：235-246．

2009-07-17)

(本文编辑：吕芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.03.025

福建省自然科学基金(2008J0086)

350001 福州，福建医科大学附属协和医院普外科

黄鹤光，Email:hhuang@yahoo.com.cn