5-羟色胺2A受体阻滞剂保护糖尿病大鼠阴茎勃起功能作用的研究△

宁夏医科大学附属医院(银川 750004)

陈 凌 何兰杰★ 李国徽*

勃起功能障碍(Erectile dysfunction,ED)是糖尿病常见并发症(DED),其发病机制尚不十分清楚,也缺乏有效的防治措施。血管因素在 DED形成过程中起着重要的作用,主要包括由舒缩血管因子比例失衡引起的血管舒缩活动紊乱及血管系统的病理损伤。5-羟色胺(5-Hydroxytryptamine,5-HT)是一种具有多种功能的神经介质和血管活性物质,通过作用于血小板和血管内 2A型受体(5-HT2AR)参与了包括血小板聚集、活化、血栓形成、血管收缩等病理过程。已知糖尿病病人血清 5-HT浓度明显增高,其通过 5-HT2AR收缩血管的效应显著增强。此外,5-HT及其 2A型受体在血管内皮损伤、血管平滑肌增生及迁移、动脉粥样硬化等过程中起重要作用,认为5-HT及其 2A型受体与糖尿病血管功能紊乱及组织病变关系密切。本实验通过观察 5-HT2A受体阻滞剂对糖尿病大鼠阴茎 eNOS表达水平及血清 NO、ET-1、5-HT的含量、阴茎组织病变的影响,探讨 5-HT及其 2A型受体参与DED发病的机制。

材料与方法

1 材 料

1.1 试剂:链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ):美国 sigma公司。盐酸沙格雷酯(Sarpogrelate hydrochloride安布乐克):日本三菱制药株式会社,生产批号:HG01。枸橼酸西地那非(Sildenafil citrate万艾可):辉瑞制药有限公司,生产批号:55883002。阿朴吗啡(APO):美国 Sigma公司。血清 5-HT、ET-1 ELISA检测试剂盒,大连范邦生物科技有限公司 。血清 NO检测试剂盒:南京建成生物工程有限公司。免疫组织化学 SP试剂盒:DAB显色液、兔抗大鼠 eNOS抗体(工作浓度 1∶100):武汉博士德生物有限公司。

1.2 实验动物及分组:2月龄雄性 SD大鼠 70只,体重(245±25)g(宁夏医学院动物实验中心提供)。大鼠适应饲养 1周,APO试验阳性后,随机分为常规饲料喂养组(A组 n=10),高脂高糖喂养组(B组n=60)。实验期间大鼠自由进食、饮水。

2 方 法

2.1 糖尿病模型建立:B组大鼠高脂高糖喂养 8周后腹腔注射STZ 35mg/kg。A组大鼠常规饲料喂养,注射相同数量枸橼酸缓冲液。注射 STZ 72h后,强生微量血糖仪检测尾尖血糖,以血糖≥11.1mmol/L并持续 3d作为糖尿病动物模型建立标准。将成模大鼠随机分成三组:糖尿病组 25只(DM)、盐酸沙格雷酯干预组 14只(SH)、西地那非组14只(WG)。A组大鼠作为正常对照组(NC)。SH组大鼠给予盐酸沙格雷酯100mg/(kg· d)灌胃,共12周;WG组大鼠在进行APO诱导阴茎勃起实验前 3d给予西地那非20mg/(kg· d)灌胃;NC与DM组给予等量饮用水灌胃。全部大鼠于灌胃后第 12周处死。

2.2 实验方法

2.2.1 一般项目:观察动物的精神状态、毛色、饮食状况,每 4周称量体重1次,并测量尾尖血糖。

2.2.2 阴茎勃起试验:在第 0、4、8、12周进行APO诱导阴茎勃起试验,参考 Heaton等皮下注射APO的方法[1]。大鼠置于安静且光线暗的环境中,称重后,每只大鼠在颈部皮下注射 APO,剂量为80μg/kg。阴茎头露出,包皮后退,阴茎膨大为阴茎勃起 1次,视为APO实验阳性。每只大鼠观察 30min记录,阴茎勃起次数和勃起率,以阴茎无勃起为判断 ED标准。

2.2.3 血清 NO检测:硝酸还原酶法测定,按试剂盒说明操作。

2.2.4 血清胰岛素 5-羟色胺(5-HT)、内皮素-1(ET-1)ELISA检测,按试剂盒说明操作。

2.2.5 免疫组织化学检测:采用 SP法,严格按说明书步骤进行操作。实验同时采用 PBS代替一抗作为阴性对照,以已知阳性片作阳性对照。以 DAB显色,苏木素复染。显色结果在高倍镜下根据染色区变化和染色强度进行半定量分析:0分,无阳性染色染色(染色面积 0～25%);1分,轻度阳性(染色面积 26%～50%);2分,中度阳性(染色面积 51%～75%);4分,重度阳性(染色面积 76%～100%)。

2.2.6 常规 HE染色及H-600透射电镜观察形态:完整切取阴茎海绵体组织,剪去包皮及软骨,横切一小段立即浸入10%甲醛溶液固定,石蜡包埋,制备4μm厚的切片;另切一段阴茎组织,低温下细切为1mm×1mm×1mm小块,置于含 4%戊二醛中前固定,留于透射电镜检测。

2.3 统计学处理:应用 SPSS12.0统计学软件,实验数据以±s表示,各组数据采用 ANOVA方差分析,同时行多样本均数间的两两比较,免疫组织化学半定量评分采用秩和检验。

结 果

1 一般情况及生化变化:未成模大鼠 7只,有19只大鼠在注射 STZ后不同时期死亡。实验结束时,NC组 10只,DM组 18只,SH组 8只,WG组 8只。糖尿病大鼠均出现典型“三多一少”症状,毛发枯黄无光泽,部分大鼠出现烂尾、肢体感染和溃疡等合并症。12周时 DM、SH、WG组血糖水平较 NC组明显升高(P＜0.01)。与DM组相比,盐酸沙格雷酯干预治疗未改善糖尿病大鼠的多饮、多尿、多食、体重减轻的症状。SH组血糖水平较 SL、DM、WG组有所下降,但各组之间血糖无显著差异,见表1。

2 大鼠阴茎勃起功能 APO实验测定:DM组阴茎勃起率、勃起次数随糖尿病病程延长呈进行性下降趋势。与NC组相比,DM组大鼠各期勃起次数均明显低于NC组 P＜0.01),两组比较 8周时 P＜0.05,12周时 P＜0.01。WG组为阳性对照组,西地那非干预能显著改善大鼠勃起功能,与DM组相比,WG组各期勃起次数及勃起率有不同程度上升,其中 4、8周勃起次数比较 P＜0.01,WG组各期勃起率均高于同期 DM组水平,但无统计学差异。与DM组相比,SH组各期勃起率及勃起次数均高于同期 DM组相应指标水平,8周时勃起次数比较 P＜0.05。与WG组比较,4周时SH组勃起率及勃起次数均低于WG组(P＜0.05),8周时 SH上述指标与WG组接近(P＞0.05),12周时SH组勃起率均高于WG组,同期勃起次数 SH组高于WG组,但无统计学差异,见表2。

3 干预治疗对血清 NO、ET-1、5-HT及NO/ET-1的影响:12周病程 DM组大鼠血清 NO浓度显著下降,5-HT、ET-1明显升高,NO/ET-1比值显著下降,与NC组相比 P均＜0.01。WG组上述指标与DM组比较无明显差异。与DM组相比,SH组血清 NO浓度、NO/ET-1比值上升,血清 ET-1、5-HT水平下降,NO浓度比较 P＜0.05,NO/ET-1、5-HT比较 P＜0.01,ET-1比较无统计学差异,见表3。

表1 各组大鼠血糖、体重比较

表2 各组大鼠阴茎勃起次数和勃起率情况

表3 各组大鼠血清学指标比较

图1 各组 eNOS免疫组化染色结果对比观察(HE×400)(A:正常组,B:糖尿病组,C:盐酸沙格雷酯高剂量组)

4 免疫组织化学结果:正常大鼠阴茎 eNOS表达于血管内皮细胞胞浆中,阳性显色为褐色。实验 12周末,半定量分析结果表明,DM组大鼠阴茎海绵体eNOS阳性染色强度显著减弱,染色面积减少(P＜0.01)。盐酸沙格雷酯治疗后 eNOS表达较 DM组明显上调(P＜0.01),见表4,图1。

5 阴茎海绵体病理改变光镜、电镜下观察结果:HE染色,光镜下观察。NC组:血窦分布均匀、神经组织及血管腔结构,血窦内少见血小板,间质组织无增生。WG、DM组:血窦分布杂乱,间质组织增生明显,血窦腔狭窄、闭塞,内可见大量血小板成分。SH组:血窦分布均匀,窦腔狭窄程度较 DM组明显减轻,内少见血小板成分,间质组织增生不明显,海绵体组织结构基本完整,见图2。

表4 各组阴茎海绵体 eNOS免疫组化检测半定量分析结果

图2 各组阴茎海绵体病理结构对比观察(HE×400)(A:正常组,B:糖尿病组,C:盐酸沙格雷酯高剂量组)

图3 阴茎海绵体超微结构对比观察(×5000)(A:正常组,B:糖尿病组,C:盐酸沙格雷酯高剂量组)

电镜观察显示,NC组:血窦内皮细胞质膜完整,胞浆丰富,可见多量质膜小泡,胞核型态正常;间质组织散在分布其中。DM组、WG组:血窦内皮细胞增生明显,胞质浓集,其内内质网及线粒体等细胞器亦明显减少,少见质膜小泡,染色质边集或聚集成块;增生内皮细胞形态肥大,程多边形,相互拥挤于血窦腔内,血窦腔被部分或全部堵塞;间质组织增生明显,成纤维细胞增生,型态异常,染色质凝集现象明显,胶原大量堆积,排列密集。SH组:损伤较 DM组明显减轻,海绵窦组织结构完整、细胞形态近于正常,内皮细胞无明显增生,胞浆丰富,内可见较多质膜小泡,染色质无明显聚集现象,胶原无明显增生现象,见图3。

讨 论

血管舒缩动态平衡的正常调解是阴茎勃起的关键,任何损害或干扰这一调节过程的因素均会导致阴茎海绵体血流动力学发生变异,直接诱发 ED。5-HT是重要血管活性物质,它通过 5-HT2A受体发挥收缩血管的效应[2]。糖尿病时 5-HT的血清浓度明显增高,这在以往及本研究中得到证实。糖尿病增高的血清 5-HT主要是由过度活化的血小板释放而来[3]。此时,5-HT通过其 2A型受体收缩血管的效应明显增强[4]。实验中 SH组 DM大鼠血清 5-HT明显下降,说明 5-HT2A受体阻滞剂可有效抑制糖尿病时血小板的过度活化,这一变化势必减弱其收缩血管效应的发挥,同时抑制由于血小板过度活化和脱颗粒造成的血栓形成、血管内皮细胞损伤及进一步血管病变的发生,这些均有助于阻止 DED的发生和发展。此外,5-HT2A受体阻滞剂阻断血管上 5-HT2A型受体,从而抑制 5-HT的缩血管作用,进一步校正糖尿病时血管舒缩平衡紊乱,改善 DED病情。值得注意的是,5-HT2A受体阻滞剂不仅可以减少作为缩血管物质—5-HT本身的释放,同时可以阻断其收缩血管效应发挥的媒介-5-HT2A受体,达到最大抑制血管收缩效应,这是其它受体阻滞剂所没有的特点。

NO在调解阴茎血流量方面起重要作用,其浓度及功能的变化所导致的血管舒缩失衡是 DED的重要发病机制之一[5,6]。阴茎组织中的NO是由 nNOS和eNOS两个酶系所激发,大量研究表明,eNOS在阴茎勃起过程中起到至关重要的作用[6～8]。糖尿病导致 NO合成减少,eNOS表达下降是其主要原因之一。许多研究表明伴随糖尿病模型实验动物勃起功能的下降,阴茎海绵体内 eNOS蛋白及基因表达均明显下调,海绵体 NO浓度也相应下降[9,10]。本实验与上述研究结果一致,说明糖尿病导致阴茎海绵体 eNOS表达下调进而引起的NO分泌减少是 DED发病机制之一。实验中5-HT2A受体阻滞剂干预后海绵体 eNOS表达较 DM组明显上调,血清 NO含量较 DM组升高,大鼠阴茎勃起功能有不同程度的改善。这一结果说明,5-HT2A受体阻滞剂保护糖尿病大鼠阴茎勃起功能的另一途径是上调海绵体 eNOS的表达,增加 NO的分泌,纠正血管舒缩因子平衡紊乱,促进血管扩张和海绵体充血。实验提示 5-HT收缩血管的另一机制可能是抑制内皮细胞eNOS的表达。

在正常生理条件下,由于5-HT血清浓度较低,加之众多血管活性因子相互作用的协调,5-HT及其 2A型受体收缩血管的效应在机体正常调节下维持适当的水平,但糖尿病时增高的血清 5-HT对血管的收缩效应可能被大大扩增,特别是在可以拮抗其作用的舒血管物质(NO)同时减少或活性降低的情况下就更为严重。从这一意义上来说,糖尿病时由 5-HT及其 2A受体引起的血管收缩效应的增强而导致的血管舒缩平衡紊乱在 DED发病中所起到的作用可以不亚于由于NO合成减少及活性降低对 DED发病的贡献作用。5-HT2A受体阻滞剂可以改善糖尿病大鼠勃起功能的结果表明,缩血管作用的增强是 DED发病的重要原因之一,单纯增加舒血管物质的疗法对于DED是不全面的。

血管内皮细胞在血管张力的调节中起重要作用。内皮细胞损伤及功能障碍是导致血管功能紊乱、组织病理改变的基础[11]。糖尿病导致血管内皮细胞功能损伤,主要表现为对舒血管物质反应的减弱和对缩血管物质的高敏感性,同时内皮细胞所分泌的舒缩血管活性物质之间的比例失衡[12]。上述改变阻碍阴茎勃起时血管的舒张和海绵体充血,导致 DED的发生。随着糖尿病病程的进展,内皮细胞损伤进一步发展,使其抗凝、纤溶和血管活性物质代谢以及调节血管张力等功能障碍或丧失,导致血栓形成、血管阻赛、动脉粥样硬化的发生、发展,这些病理改变都是 EDE的发病机制之一。组织病理学观察结果及血清 NO、NO/ET-1变化情况表明盐酸沙格雷酯有显著保护内皮细胞的作用。5-HT2A受体阻滞剂治疗 DED的另一途径是保护内皮细胞,阻止内皮细胞增生、损伤,从而延缓、阻止进一步严重血管系统病变的发生。另外,此作用可能是 5-HT2A受体阻滞剂上调 eNOS表达的机制之一。

经各项试验结果的对比观察可以得出结论,5-HT2A受体阻滞剂保护 DM大鼠阴茎勃起功能的机制不同于西地那非。西地那非药效的机制是在需要时短期内增强舒血管物质 NO的生理效应,从而达到促进阴茎勃起的作用。这一机制对于NO合成显著下降的DM患者而言,疗效难以发挥,且经本实验证实西地那非对糖尿病阴茎组织病变无显著影响。据此推测,对已存在组织病变的患者其疗效非常有限。而 5-HT2A受体阻滞剂在纠正血管舒缩平衡紊乱的同时,对糖尿病阴茎组织病理损伤有明显的改善作用,这也是其保护阴茎勃起功能显效较晚的主要原因。虽然 5-HT2A受体阻滞剂在短时间内增加舒血管效应的作用低于西地那非,所以在 DM早期其改善勃起功能的作用有限,但随 DM病情的进展,该药改善糖尿病大鼠阴茎组织病理损伤状况的作用凸现,此时其作用逐渐显现。

综上所述,5-HT2A受体阻滞剂对糖尿病大鼠阴茎勃起功能有保护作用,它能使阴茎 eNOS表达上调,血清 NO浓度、NO/ET-1比值上升,改善糖尿病大鼠阴茎组织病理损伤状况,保护内皮细胞,抑制胶原增生。结合 5-HT、5-HT2A受体在糖尿病大鼠海绵体表达的变化情况,可以得出结论5-HT及5-HT2A受体在 DED的发生中起重要作用,5-HT2A受体阻滞剂可能成为防治 DED的另一条途径。

[1] Heaton JPW,Varrin S,Morales A.The characterization of a bioassay of erectile function in a rat model.JUrol,1991,145(5):1099.

[2] Van Nueten JM,Janssens WJ.Augmentation of vasoconstrictor responses to serotonin by acute and chronic factors:inhibition by ketanserin.J Hypertens.1986,4:S55-S59.

[3] James GM,Hodgson WC.A role for protein kinase Cin the attenuated reponse to 5-hydroxytryptamine in aortas from streptozototocin diabetic rats.Eur J Pharmacol,1997,322(1):55-58.

[4] Hattori Y,Kawasaki H,Kanno M,etal.Enhanced 5-HT2 receptor mediated contractions in diabetic rat aorta:participation of Ca2+channels associated with protein kinase C activity.JVasc Res,1995,32(4):220-229.

[5] Andersson KE.Erectile physiological and pathophysiological pathways involved in erectile dysfunction.JUrol,2003,170:S6-S14.

[6] Burnett AL,Lowenstein CJ,Bredt DS,etal.Nitric oxide: a physiologic mediator of penile erection.Science,1992,257:401-403.

[7] Burnett AL,Tillman SL,Chang TS,etal.Immunohistochemical localization of nitric oxide synthase in the autonomic innervation of the human penis.JUrol,1993,150:73-76.

[8] Moreland RB,Hsieh G,Nakane M,etal.The biochemical and neurologic basis for the treatment of male erectile dysfunction.J Pharmacol Exp Ther,2001,296:225-234.

[9] Akingba AG,Burnett AL.Endothelial nitric oxide synthase protein expression,localization,and activity in the penis of the alloxan-induced diabetic rat.Mol Urol,2001,5:189-197.

[10] Ari G,Vardi Y,Finberg JP.Nitric oxide and penile erection in streptozotocin-diabetic rats.Clin Sci(Lond),1999,96:365-371.

[11] Solomon H,Man JW,Jackson G.Erectiledysfunction and the cardiovascular patient:endothelial dysfunction is the common denominator.Heart,2003,89:251-253.

[12] Trinity J.Bivalacqu A,Mustafa F,etal.Endothelial dysfunction in erectile dysfunction: role of the endothelium in erectile physiology and disease.J Andrology,2003,24:90060.