紫杉醇己内酯/碳酸亚乙酯载药纳米涂层制备及其体外实验研究

杨进　梅劲桦　刘震杰

[摘要] 目的 构建紫杉醇己内酯（CL）/碳酸亚乙酯（EC）载药纳米涂层，考察其体外释放情况并评价其对血管内皮细胞和平滑肌细胞存活率的影响。 方法 结合异步降解技术和静电纺织技术制备紫杉醇Poly（CL-co-EC）载药纳米涂层；高压液相色谱法测定载药体系紫杉醇包封率和体外释放曲线；MTT实验测定人血管内皮细胞和平滑肌细胞存活率。 结果 CL/EC=6和CL/EC=9的紫杉醇Poly（CL-co-EC）的药物包封率分别为92.1%和79.2%；载药量分别为26.5%和18.1%；紫杉醇在体外缓慢释放，50d后累计释放量分别达到78%和37%。紫杉醇Poly（CL-co-EC）电纺薄膜显著降低血管内皮细胞和平滑肌细胞的存活率。 结论 紫杉醇Poly（CL-co-EC）载药纳米涂层具有缓慢释放和释放速率可控的特点，具有作为血管内支架的潜在价值。

[关键词] 己内酯；碳酸亚乙酯；紫杉醇；纳米涂层；血管支架

[中图分类号] R318.08 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2015）01-78-04

[Abstract] Objective To establish a nano-coating of paclitaxel loaded ε-aprolactone/Ethylene carbonate copolymer and investigate the release of the nano coating and effects on inhibition ratio of vascular endothelial and smooth muscle cells. Methods The technology of asynchronous degradation and electrostatic spinning technique were used to prepare nano-drug carrier. High pressure liquid chromatography （HPLC） was used to determine the embedding ratio and release curve of paclitaxel loaded nano coating. MTT was applied to test cells survival rate. Results The embedding ratios of paclitaxel in nano-coatings of CL/EC=6 and CL/EC=9 were 92.1% and 79.2%， and drug-loading rate were 26.5% and 18.1%， respectively. Paclitaxel in nano-coatings were slow-release and the accumulative release quantities were 78% and 37% in vitro. The nano-coatings significantly reduced the survival rate of vascular endothelial and smooth muscle cells. Conclusion The nano-coatings of paclitaxel loaded ε-aprolactone/ethylene carbonate copolymer established in this study slowly releases paclitaxel and inhibits the growth of vascular endothelial and smooth muscle cells， which supplies a potential value in stent implantation.

[Key words] ε-aprolactone； Ethylene carbonate； Paclitaxel； Nano-coating； Intravascular stent

随着膳食结构西方化和人口老龄化问题的日益突出，心血管疾病的发生率和死亡率逐年增加[1]。介入治疗是目前动脉粥样硬化性冠心病治疗的主要手段，包括经皮冠状动脉成形术、动脉粥样化切除术和血管支架植入术[2]。其中经皮冠状动脉成形术有30%～50%患者在术后6个月内出现再狭窄或其他血管堵塞问题[3]，术后辅助支架植入可以降低血管再狭窄比例，但6个月内再狭窄仍高达20%～30%[4]。药物洗脱支架是通过将支架上负

载药物定点释放到狭窄部位，确保药物对病灶疗效最大化，并将对其他器官的毒副作用降到最小，问世后极大的改善了介入手术在心血管疾病治疗中的效果[5-6]。

紫杉醇作为抗增殖药被广泛使用，它是从红豆杉科红豆杉属植物中提取得到的二萜类化合物，能使细胞停留在G2/M期，导致细胞死亡，从而起到抗增殖的作用[7]。研究表明紫杉醇洗脱支架可降低隐静脉移植物病变患者术后血管再狭窄率[8]。

己内酯和碳酸亚乙酯共聚物[Poly（CL-co-EC）]具有良好的生物相容性和理化性能[9]，并且结合电纺丝技术可以制作比用常规方法小几个数量级的纳米级纤维 [10]，易于实现药物在局部的长时间停留，便于释放靶向控制。但关于紫杉醇Poly（CL-co-EC）的建立还鲜有报道，本研究结合异步降解技术和静电纺织技术制备紫杉醇Poly（CL-co-EC）载药纳米涂层，并通过体外实验评价其对原代人血管内皮细胞和平滑肌细胞的抗增殖效果。旨在为今后研制抗内膜增殖程序化药物释放血管内支架的研制提供前期研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

己内酯（Acros，99%）；碳酸亚乙酯（Acros，99%）；紫杉醇原料药（纯度>99%，中国桂林晖昂生化药业有限公司）；噻唑兰（MTT，南京建成生物工程研究所）；二甲基亚砜（DMSO，Sigma公司）；RPMI-1640（Gibco公司）；高效液相色谱仪（美国Waters公司）；激光粒度仪（英国Malvern instruments公司）；酶标仪（美国Molecular Devices公司）；二氯甲烷和丙酮为分析纯，乙腈和甲醇为色谱纯。

1.2 载药纳米微粒的制备

1.2.1 Poly（CL-co-EC）共聚物的制备 共聚物Poly（CL-co-EC）的制备参照已发表文章[9] 中相关步骤进行，概括如下：（1）氩气环境下，使用Nd（DBMP）3催化合成CL/EC比例不同比例的共聚物Poly（CL-co-EC）。（2）样品模压制备成长×宽×高为30mm×12mm×2mm的规整板材。（3）使用静电纺丝法制备纳米级的纤维和膜材料。通过调节电压（0 ～ 10kV）、纺丝液流速（0.1 ～ 5mL/h），制备不同纳米直径的纤维。

1.2.2 紫杉醇的包埋 对CL/EC=9的Poly （CL-co- EC）共聚物混合己二酸酐进行电纺制备孔隙率在90%以上的电纺膜，电纺丝直径在400～800nm。先期在生理盐水中静置3d，酸酐降解后进行扫描电镜观察，并用DMSO溶解紫杉醇，包裹于共聚物颗粒中，颗粒直径在100nm左右。在常温下，将先期降解后的Poly（CL-co-EC）电纺膜置于DMSO溶液中24h。

1.3 共聚物载药量及包封率的测定

采用高压液相色谱法（HPLC）测定紫杉醇Poly（CL-co-EC）载药纳米涂层的载药量，取载有紫杉醇的共聚物约2mg，精密称定，溶于5mL乙腈中，加入蒸馏水定容至10mL，摇匀，滤过，作为样品溶液。采用外标一点法测定，外标为紫杉醇对照品。HPLC实验条件：反相C18色谱柱（150.0mm×4.6mm，5m）；流动相为乙腈-水（50：50，V/V）；流速为1.0mL/min；检测波长为227nm。

载药量（%）=（纳米粒中紫杉醇的质量/纳米粒的质量）×100%

1.4 药物体外释放实验

准确称取紫杉醇加磷酸盐缓冲溶液稀释制成均一悬浮液，置于37℃恒温水浴摇床中，以130r/min条件下进行释放实验。每隔24h用等体积新鲜缓冲液更换一次释放液，更换出的释放液用HPLC测定紫杉醇浓度，HPLC实验条件同载药量与包封率测定。计算出释放量，绘制累积释放曲线。

1.5 体外细胞实验

1.5.1 血管内皮细胞和平滑肌细胞原代培养 取人体废弃大隐静脉10～15cm，PBS溶液洗去残血，0.1%的粗制胶原酶消化3～10min，得到含内皮细胞的消化液，PBS溶液冲洗后离心去上清，加入RPMI 1640培养液制成细胞悬液，在37℃、5%的二氧化碳孵育箱中培养，取对数生长期的细胞进行试验。

取人体废弃大隐静脉，刮去动脉外膜和内膜脂滴，剪成碎块均匀铺于培养瓶里，滴少许含20% FCS的DMEM湿润培养瓶，后加3～5mL DMEM（含20% FCS）到培养瓶内，使铺组织块的一面向上，置于孵育箱里，约5h后翻正，静置培养1周，取对数生长期的细胞进行试验。

1.5.2 MTT法检测细胞存活率 以104/孔密度接种于96孔细胞培养板，每孔200μL，每组均设6个复孔。细胞贴壁后换无血清培养基作用24h，使细胞同步于G0期，分别给予含有Poly（CL-co-EC）空载电纺膜或者载紫杉醇的Poly（CL-co-EC）电纺膜的相应血清加以刺激，于共同培养24h、48h、72h终止，刺激结束后加5mg/mL MTT 20μL/孔，37℃，5% CO2孵育4h，小心吸弃上清，加入DMSO 150μL/孔，充分混匀，在492nm波长下测定每孔OD值，计算细胞存活率

2 结果

2.3 紫杉醇Poly（CL-co-EC）电纺薄膜对血管内皮细胞存活率的影响

从图2得出，Poly（CL-co-EC）电纺薄膜对血管内皮细胞存活率无显著影响，紫杉醇加载后，细胞存活率显著下降，并随着时间的延长细胞存活率越低。CL/EC=6的载紫杉醇电纺薄膜较CL/EC=9有更低的细胞存活率，且在72h达到差异有统计学意义（分别为54%和70%）。

2.4 紫杉醇Poly（CL-co-EC）电纺薄膜对血管平滑肌细胞存活率的影响

从图3得出，紫杉醇Poly（CL-co-EC）对血管平滑肌细胞存活率的影响与血管内皮细胞基本一致：空载Poly（CL-co-EC）电纺薄膜组与空白组差异无统计学意义，电纺膜加载紫杉醇后，细胞存活率显著下降，并随着时间的延长细胞存活率越低，CL/EC=6与CL/EC=9的载紫杉醇电纺薄膜相比有较低的细胞存活率，72h后，两种不同比例CL/EC载紫杉醇电纺薄膜使血管平滑肌细胞存活率分别下降到空白组的65%和76%。

3 讨论

临床上药物洗脱支架的应用大大改善了介入治疗造成动脉粥样硬化性冠心病的血管再狭窄问题，被称为是介入治疗的第三里程碑[5]。目前可降解合金和可降解高分子这两大类材料在制备血管支架方面已得到大量研究。基于高分子材料的选择范围宽、力学性能更多样，同时易于做药物涂布，使它在支架制备中使用更加广泛[11]。在我们前期的研究中[9]，利用Nd（DBMP）催化聚碳酸亚乙酯和己内酯并通过改变反应单体比例、反应时间、加样顺序合成了一系列不同CL/EC比例的Poly（CL-co-EC）共聚物。本研究中，选择CL/EC=9和CL/EC=6的Poly（CL-co-EC）作为紫杉醇的药物载体。

通过HPLC检测涂布紫杉醇的Poly（CL-co-EC）共聚物体外释放情况，发现紫杉醇在50d的实验过程中呈缓慢释放，到50d，CL/EC=9和CL/EC=6的紫杉醇载药聚合物的累积释放量分别达到37%和78%，预测紫杉醇会随着实验时间的延长继续释放。CL/EC=6的累积释放量更高是由于其EC含量更高，共聚物降解时间较CL/EC=9短，所以使得更多紫杉醇释放出来。结合前期研究，可以看出通过调节CL/EC比例得到降解时间不同的Poly（CL-co-EC）高分子材料，更利于控制药物释放的速率。

MTT实验检测细胞存活率，得到包埋紫杉醇的Poly（CL-co-EC）具有抑制血管内皮细胞和血管平滑肌细胞存活率的作用。研究表明紫杉醇能通过诱导和促进微管蛋白聚合，并使细胞停留在G2/M期，进一步促进细胞的死亡，被广泛的用于抗肿瘤和抗细胞增殖[7]，但临床常用的注射液剂型极易引起过敏等众多严重不良反应[12]，将紫杉醇包埋于高分子材料能显著降低这些不良后果的出现，为紫杉醇能被更广泛更安全地使用提供新思路。

本研究得出紫杉醇Poly（CL-co-EC）载药纳米具有缓慢释放药物的特点，并可通过调节CL/EC比例控制药物释放速度，具有较高的临床应用价值。

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（收稿日期：2014-09-09）