苯丙氨酸羟化酶基因突变家系PCR-SSCP分析①

邵诸君 王凤羽 耿尧 丰慧根

(1.新乡医学院生命科学技术系 河南 新乡 453000; 2.河南省人口与计划生育科研院遗传室 河南 郑州 450002;3.河南省人口与计划生育科研院遗传室 河南 郑州 450002; 4.新乡医学院生命科学技术系 河南 新乡 453000)

苯丙酮尿症(phenylketonuria;PKU)是比较常见的单基因遗传代谢病,属常染色体隐性遗传,OMIM编号为261600。PKU是由苯丙氨酸羟化酶(Phenylalanine hydroxylase,PAH)基因突变导致的肝脏该酶活性降低或丧失所致。目前,最常用的确定基因突变来源的分析方法是PCR-STR连锁分析,不过这种方法属对基因突变的间接诊断,存在一定的局限性。本研究应用PCR-SSCP检测方法对PKU患者的家系进行分析,以便将来把PCR-SSCP更好地应用于PKU产前诊断。

1 对象与方法

1.1 研究对象

15例经郑州大学第三附属医院新生儿筛查中心确诊的经典型PKU患者及其双亲作为研究对象。PKU患者中,男9例,女6例,年龄为1～11岁,平均3.4岁,7例患者为出生后筛查诊断,4例为出生后6个月～1.5岁获得诊断,所有PKU患者均经低苯丙氨酸饮食治疗。无PKU家族史的正常人作为正常对照。

1.2 方法

1.2.1 DNA制备和PCR扩增 提取患者及双亲和正常人的外周血,采用经典的酚、氯仿法提取基因组DNA,TE溶解,-20℃备用。第3、5、6,7、11外显子及旁侧内含子扩增引物参照文献[1]由上海生工合成。PCR扩增体系：总体积25μL,含1×PCR-Buffer、50mmol/L dNTP、1.5 mmol/L MCl、正、反向引物各10pmol、Taq DNA聚合酶0.25U、基因组DNA100ng。反应条件：先95℃变性5min,然后94℃30s,56℃复性30s,72℃延伸45s,共35个循环,70℃延伸10min,2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.2 SSCP-非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染分析8%非变性聚丙烯酰胺凝胶(29∶1;含5%甘油),垂直电泳(胶长16cm),垂直电泳槽于4℃冰箱,预电泳30 min,PCR产物4uL与等体积SSCP上样缓冲液(95%甲酰胺,0.5mL 0.5M EDTA,0.05%溴酚蓝,0.05%二甲苯晴)混合,97℃变性3min,立即置于冰水混合物中5min,快速上样,电压300V,4℃恒温电泳4～6h。用银染色法显示扩增DNA区带,扫描仪(清华紫光)扫描,分析结果确定突变基因的来源,并通过PCR正反测序证实。

2 结果

15个PKU家系的PCR-SSCP检测及PCR测序结果显示：15例患者中共检出10种PAH基因突变总共14个突变等位基因来源(父或母)均得到确定,突变类型包括错义突变,无义突变,缺失和同义突变等;1例患者(突变基因型为G247V/R243X)的基因突变来源未能通过SSCP方法确定(表1),另有4个家系未检测到基因突变。

3 讨论

PAH基因内含子3中STR的(TCTA)核心序列重复,虽然具有高度多态性,能够用于家系连锁分析,检出突变基因。对PKU家系PCR-SSCP分析显示：此方法在确定PAH基因突变来源方面具有很好的应用价值。从图1可知,1～3道为G247R杂合突变家系,G247R杂合子患者的正常电泳条带存在,多了一条异常电泳条带,母亲的异常电泳条带与患者的一致,说明患者遗传了母亲的一条异常染色体,经测序证实母亲为G247R突变携带者(图2：a);4～6道为R243Q突变家系,R243Q纯合子患者的一条异常电泳条带与父亲和母亲的异常电泳条带一致,并出现正常条带的缺失,说明两个突变等位基因一个来源于父亲,另一个来源于母亲,经测序证实父母均为R243Q突变基因携带者(图2：b)。由图1可知,SSCP结果无正常电泳条带的缺失,说明为外显子7的突变杂合子,此结果也在第3、5、6、11外显子的SSCP分析中得到验证;若出现正常条带的缺失,则很可能为突变纯合子患者。

1例患者的基因型为G247V/R243X,突变来源未能确定。此患者的SSCP多了一条异常电泳条带与父亲的电泳条带一致,其母亲的电泳条带与正常电泳条带无差别,经测序证实父亲为R243X突变杂合子,母亲为G247V突变杂合子,变换SSCP检测条件(用不同比例和浓度的凝胶,改变电压,温度等),仍然不能确定突变基因来源。原因可能是由于G247V突变DNA链与正常DNA链的空间构像相似,或者虽然空间构像不同,其在凝胶电泳时与正常DNA链的迁移速率差异较小。本研究中另1例患者的基因型为R243Q/R261X,2种突变也位于外显子7,患者的电泳条带多了2条异常条带,父母各多了1条异常带,根据异常条带的位置虽不能明确父母携带的基因突变类型,但如进行产前诊断时则可给出较明确的结论。

PCR-SSCP分析方法可以很好地应用于判断PKU患者的基因突变来源,其结果清晰,容易判断,如果应用于产前基因诊断时,在传统的STR连锁分析无能为力时,SSCP分析依然能够显示其独特的优越性：(1)只要患者的突变能够通过SSCP方法检测出异常,就可通过此分析方法确定突变的亲代来源;(2)能够区分杂合与纯合突变;(3)能够在缺少先证者的情况下对胎儿进行产前诊断。这些优点是传统的STR连锁分析所不可能达到的。尽管如此,PCRSSCP应用于基因诊断和产前诊断时也存在不足之处：(1)由于SSCP对突变检测敏感性的限制,仅适用于能够通过SSCP检测到的突变;(2)由于不同浓度和比例的聚丙烯酰胺凝胶,温度,电压等条件对同一DNA样本会造成电泳行为的差异,而且PAH基因突变类型复杂多样,不能仅仅根据突变条带的位置确定突变类型;(3)对2个突变位于同一外显子的杂合子患者,SSCP分析方法不能很好地判断突变来源;(4)患者经SSCP检测出的异常后必须要通过测序证实其为致病突变后才能使用SSCP分析方法进行产前诊断,因为同义突变(如Q232Q突变)也能造成DNA链电泳行为的异常,在应用于基因诊断和产前诊断时应特别注意。

表1 PKU家系PCR-SSCP分析结果

图1 PAH基因外显子7的SSCP图

图2 PAH基因突变PCR测序图如下(与图1相对应)

总之,PCR-SSCP是一种能够用于确定PKU患者基因突变来源和进行PKU产前基因诊断较为理想的检测方法,对促进人类优生事业的发展具有积极意义。

[1]张志,庄俊汉,黄宗青,等.经典型苯丙酮尿症基因全长外显子的突变检测和分析[J].中国优生遗传杂志,2006,14(5):14～21.

[3]Woo SLC, Lidsky A, Law M,et al. Regional mapping of the human phenylalanine hydroxylase gene and PKU locus to 12q21-qter.(Abstract) Am[J].J. Hum. Genet. 1984,36:210S only.