龙井乙醇提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用

马燕燕，鲁晓翔

（天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术重点实验室，天津300134）

龙井乙醇提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用

马燕燕，鲁晓翔*

（天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术重点实验室，天津300134）

以龙井、柿叶、贡菊和银杏叶为原料，用L-酪氨酸和L-DOPA为底物测定各原料的乙醇提取物对酪氨酸酶的抑制作用。结果表明，四种原料的乙醇提取物对酪氨酸酶均有一定的抑制作用，以龙井的抑制率最高，当浓度达到4mg·mL-1（以生药计）时，抑制率为30.36%，其IC50值为7.5mg/mL。龙井乙醇提取物对酪氨酸酶的抑制作用属于可逆过程，其抑制类型为混合型，KI为3.1，KIS为9.3。

酪氨酸酶，龙井乙醇提取物，抑制作用，动力学

酪氨酸酶（tyrosinase，EC1.14.18.1）具有多种特征性催化活性，广泛存在于人、动物、植物和微生物中，是一种以Cu2+为辅助因子的金属酶［1-3］，兼有加氧酶和氧化酶的双重功能，它能够催化单酚羟化成二酚，并把二酚氧化成醌；醌在非酶促条件下形成反应终产物黑色素。这一过程主要与人体色素沉着性疾病、果蔬褐变及昆虫的伤口愈合等有密切的关系。因此，多年来酪氨酸酶一直受到国内外的关注，其研究涉及生物、医学、农学、化学、药学等学科和领域。酪氨酸酶抑制剂（Tyrosinase Inhibitor，TI）通过抑制酪氨酸酶活性从而抑制黑色素生成，它可以降低产品褐变程度从而可以作为保鲜剂，也可用于色素增加性皮肤病（黄褐斑、雀斑等）的临床治疗，还可用于化妆品使肤色增白。此外，还有可能应用于农业生产上作为一种害虫调控剂和食品工业上作为食品添加剂。由于酪氨酸酶抑制剂的应用广泛，近年来许多学者致力于寻找高效的酪氨酸酶抑制剂，并研究其抑制作用机理、抑制动力学以及应用条件等。传统的酪氨酸酶抑制剂大多是化学合成的，毒副作用明显，使其应用备受质疑。因此，从天然产物中制备酪氨酸酶抑制剂得到人们的普遍关注，是今后的主要研究方向。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

L-酪氨酸、L-多巴、酪氨酸酶（25KU） sigma公司；龙井 购于天津正兴德茶庄；柿叶、贡菊、银杏叶购于天津敬一堂药店。

RE-52A旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；UV-1700紫外可见分光光度计、AUY120电子分析天平 岛津；XH-100A微波催化合成/萃取仪 北京祥鸽科技发展有限公司；分析数据用 Excel统计软件。

1.2 实验方法

1.2.1 样品液的制备 将龙井、柿叶、贡菊和银杏叶烘干、粉碎后，分别称取粉末5g，加体积分数为60%的乙醇150mL，室温浸泡24h后，置于微波萃取仪中进行提取。提取条件为：微波功率 500W，提取30min，提取温度50℃。冷却后过滤，在50℃条件下减压浓缩，浓缩液定容于50mL容量瓶中。

1.2.2 酪氨酸酶活性抑制率的测定［4-7］原理：在酪氨酸酶反应生成黑色素的过程中，酪氨酸酶的催化作用主要发生在酪氨酸转化为多巴以及多巴转化为多巴醌这两个反应中。多巴醌是一种有色物质，在475nm处有特征吸收，故可以用分光光度计进行测定［8］。

酪氨酸酶的单酚酶活力测定是以L-酪氨酸为底物，二酚酶活力测定是以L-多巴为底物。L-酪氨酸溶液、L-多巴溶液、酪氨酸酶溶液及样品溶液均以磷酸缓冲液（pH6.8）配制。测定时，用吸管按表1所示体积，准确吸取A，B，C，D四组反应液，每组设3个平行试管，充分混匀后，在37℃水浴温育30min迅速转移至比色皿中于475nm处测吸光值。以下列公式计算酪氨酸酶的抑制百分率：

式中：A为A组反应液在475nm下的吸光度值；B为B组反应液在475nm下的吸光度值；C为C组反应液在475nm下的吸光度值；D为D组反应液在475nm下的吸光度值。

表1 反应液的组成

1.2.3 酪氨酸酶活力的测定［9］酪氨酸酶的单酚酶活力测定是以L-酪氨酸为底物，二酚酶活力测定是以L-多巴为底物。在3mL pH6.8磷酸缓冲液的测活体系中，先加入0.1mL含不同浓度的抑制剂于比色杯中，再加入2.8mL预先在30℃恒温水浴中保温的底物溶液，然后加入酪氨酸酶水溶液，立刻混匀，在30℃恒温条件下、波长475nm处测定光密度值随时间的增长曲线，酪氨酸酶活力单位（U/min）规定：以每分钟反应液在475nm波长的光密度值增加0.001为一个酶活力单位。

2 结果与讨论

2.1 四种原料乙醇提取物对酪氨酸酶活性的影响

将四种原料的乙醇提物用pH6.8的磷酸缓冲液分别配制成浓度为4mg·mL-1（以生药计）的溶液，按表1反应体系测定其对酪氨酸酶单酚酶和二酚酶的抑制率，结果见表2。

表2 4种原料对酪氨酸酶抑制率

从表2可知，龙井乙醇提取物对酪氨酸酶单酚酶的活性有明显的抑制作用，而对二酚酶活力的抑制作用不明显；柿叶、贡菊和银杏叶对酪氨酸酶单酚酶的活性抑制作用大致相同，但贡菊对酪氨酸酶二酚酶则表现出一定的激活作用。

2.2 不同浓度的龙井乙醇提取物对酪氨酸酶单酚酶的影响

将抑制率最高的龙井乙醇提取物分别配成浓度为2、4、6、8、10、20mg/mL溶液，按表1反应体系测定其对酪氨酸酶单酚酶的抑制率，结果见图1。

图1 龙井乙醇提物对酪氨酸酶活性的影响

由图1可知，龙井乙醇提取物浓度在低于15mg/mL时，其对酪氨酸酶的抑制率随着浓度增大而增强，浓度在15mg/mL时抑制率达到最大，浓度高于15mg/mL时抑制率出现下降趋势。用曲线拟合算出龙井乙醇提取物导致酶活力下降一半所需的抑制剂含量（IC50）为7.5mg/mL。

2.3 龙井乙醇提取物抑制酪氨酸酶单酚酶的动力学观察

2.3.1 龙井乙醇提取物对酪氨酸酶的抑制效应 以浓度不变的酪氨酸为底物，改变酶蛋白加入量，分别测定不同浓度龙井乙醇提取物对酪氨酸酶催化酪氨酸氧化活力的影响。图2表示酪氨酸酶经龙井乙醇提取物作用后的剩余酶活力与加入的酶量间的关系，得到一组通过原点的直线，随着加入的龙井乙醇提取物的增多，直线的斜率逐渐下降，说明龙井乙醇提取物对该酶的抑制作用属于可逆过程，增加效应物含量导致酶活力的下降，说明效应物和酶的结合导致酶活力受抑制，并不导致酶的分子构象的永久变化而失活。

图2 样品对酪氨酸酶抑制作用机理的判断

2.3.2 龙井乙醇提取物对酪氨酸酶的抑制机理及抑制常数的测定 在测活体系中，固定酶液浓度，改变底物酪氨酸浓度，测定不同浓度龙井乙醇提取物对酶活力的影响。Lineweaver-Burk双倒数作图均为相交于第二象限的一组直线，说明龙井乙醇提取物作为酪氨酸酶抑制剂，可以改变酶促反应的最大反应速度（Vmax）和米氏常数（Km），其抑制类型为混合型。图3（a）为龙井乙醇提取物对酪氨酸酶抑制作用Lineweaver-Burk双倒数图，Km值随着效应物含量的增大而增大，Vmax随着效应物含量增大而下降，表明龙井乙醇提取物既影响酶对底物的亲和力也影响酶的催化作用，该提取物既能与游离酶（E）结合，也能与酶-底物络合物（ES）结合，但抑制作用强度不同。分别以双倒数直线的斜率和纵轴截距对效应物含量二次作图，以斜率图3（b）和纵轴截距图3（c）对提取物含量作图为直线，分别可以求出效应物对游离酶抑制常数（KI）为3.1和对酶-底物络合物抑制常数（KIS）为9.3。

图3 样品对酪氨酸酶抑制类型和抑制常数的测定

3 结论

龙井、柿叶、贡菊和银杏叶提取物对酪氨酸酶单酚酶的活性有明显的抑制作用，其中龙井的抑制率最高达到了30.36%，而对二酚酶活力的抑制作用不明显，贡菊对酪氨酸酶二酚酶则表现出一定的激活作用，龙井乙醇提取物的IC50值为7.5mg/mL。

龙井乙醇提取物对酪氨酸酶的抑制作用属于可逆过程，增加效应物含量导致酶活力的下降，说明效应物和酶的结合导致酶活力受抑制，并不导致酶的分子构象的永久变化而失活。龙井乙醇提取物作为酪氨酸酶抑制剂，可以改变酶促反应的最大反应速度（Vmax）和米氏常数（Km），其抑制类型为混合型。龙井乙醇提取物既影响酶对底物的亲和力也影响酶的催化作用，该提取物既能与游离酶（E）结合，也能与酶-底物络合物（ES）结合，但抑制作用强度不同，KI和KIS分别为3.1和9.3。这说明龙井乙醇提取物对酪氨酸游离酶（E）的抑制作用较对酶-底物络合物（ES）的抑制作用强的多。本实验论证了龙井乙醇提取物对酪氨酸酶的抑制效果，为绿茶提取物在果蔬保鲜方面的应用提供了理论依据，对酪氨酸酶起抑制作用的龙井乙醇提取物的具体有效成分还有待进一步的研究。

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Inhibitory mechanism of ethanol extracts from longjing on tyrosinase activity

MA Yan-yan，LU Xiao-xiang*
（Tianjin Key Laboratory Food of Biotechnology，Biotechnology and Food Science College，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China）

Longjing，persimmon leaf，florists chrysanthemum and ginkgo biloba were used as experimental materials.The inhibitory of these ethanol extracts on tyrosinase activities were examined with L-Tryosine and LDOPA as substrate.The results showed that the ethanol extracts from 4 drugs all had obvious inhibitory activity on tyrosinase，the strongest effects occurred with longjing ethanol extract，the maximum inhibition rate was 30.36%at concentration of 4mg·mL-1，lC50was 7.5mg/mL.Ethanol extracts from longjing showed reversibly inhibitors to tyrosinase and the type of inhibition belonged to be mixed-type，Klwas 3.1and KlSwas 9.3.

tyrosinase；ethanol extracts from longjing；inhibitory mechanism；kinetics

TS201.2+5

A

1002-0306（2010）11-0141-03

2009-11-25 *通讯联系人

马燕燕（1985-），女，在读硕士，研究方向：食物资源研究与开发。