甘木通不同部位总黄酮含量的测定

胡宗礼，黄晓萍，陈珺霞

（韶关学院英东生物工程学院，广东 韶关 512005）

甘木通不同部位总黄酮含量的测定

胡宗礼*，黄晓萍，陈珺霞

（韶关学院英东生物工程学院，广东 韶关 512005）

目的：建立黄酮类化合物含量的测定方法并分别测定甘木通茎、叶中总黄酮含量。方法以芦丁为对照品建立标准曲线，以75%乙醇为溶剂在90℃加热回流提取甘木通茎、叶中总黄酮类成分，用分光光度法在波长510nm处测定总黄酮含量。结果芦丁浓度（C）与吸光度（A）间的关系为C＝0.090 244A－0.000 193 6（r＝1.000 0），回收率为101.18%，RSD＝2.36%（n＝5）。甘木通茎和叶中总黄酮含量分别为0.99%和1.20%。结论甘木通叶中总黄酮含量比茎约高出21%。

甘木通；总黄酮；分光光度法

甘木通Clematis filamentosa Dunn俗称眼蛇药，为毛茛科丝铁线莲属植物，主要分布在广东、广西、海南、云南等地，在粤北乳源山区有较为丰富的野生资源，对心血管疾病（冠心病、高血压）有显著疗效［1］。目前关于甘木通确切的有效成分尚不清楚，其提取物经盐酸镁粉反应及硝酸铝反应均呈阳性，提示甘木通含有黄酮类成分。大量研究证实黄酮类化合物具有抗心肌缺血、降血压、抗心律失常等功效［2］，结合甘木通及其制剂的临床应用，甘木通中黄酮类化合物是其有效成分之一，本实验通过对甘木通不同部位进行总黄酮含量测定，为甘木通药用部位的选定提供依据。

1 材料

1.1 药材与试药

甘木通药材（广东雷霆国药有限公司），采收于2007年10月，经韶关市药品检验所江兰英所长鉴定为甘木通Clematis filamentosa Dunn；芦丁对照品（上海国药集团化学试剂有限公司，纯度为98%）；无水乙醇、石油醚、醋酸乙酯、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠等均为分析纯。

1.2 主要仪器

JA5033型电子分析天平（上海恒平科学仪器有限公司）；725N型紫外可见光分光光度计（上海科学精密仪器有限公司）；101-1B型电热鼓风干燥箱（上海实验仪器厂）；RE-52AA型旋转蒸发器（上海雅荣生化设备仪器有限公司）。

2 方法与结果

2.1 线性考察

精密称取120℃下干燥至恒重的芦丁对照品15.00mg，置于100mL容量瓶中，加75%乙醇适量溶解后，加75%乙醇定容至刻度，摇匀，即得每1mL含无水芦丁0.15mg的对照品溶液。精密量取0.0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0mL芦丁对照品溶液，分别置于10mL容量瓶中，补充75%乙醇至5mL，摇匀；加5%亚硝酸钠溶液0.1mL，摇匀放置6min；加入 10%硝酸铝溶液 0.3mL，混匀放置6min；加入10%氢氧化钠溶液4.0mL，用去离子水补加至刻度，充分摇匀，在显色后15min以芦丁空白为对照，于检测波长510nm处测定吸光度值。结果采用最小二乘法，以芦丁浓度（C）－吸光度（A）进行直线回归，得标准曲线方程C＝0.090 244A－0.000 193 6，在芦丁浓度为0.007 5～0.06mg·mL－1线性关系良好（r＝1.000 0）。

2.2 精密度试验

精密量取0.5，2.0，4.0mL芦丁对照品溶液各3份，分别置于10mL容量瓶中，按 “线性考察”项下方法测定吸光度值，代入标准曲线方程计算SD和RSD。结果用分光光度法测定不同浓度的芦丁含量，其SD和RSD均较小，尤其是在高浓度时，说明实验数据精确，见表1。

表1 芦丁精密度试验

2.3 重现性试验

精密量取0.5，2.0，4.0mL芦丁对照品溶液各3份，分别置于10mL容量瓶中，分3组按 “线性考察”项下方法测定吸光度值，计算SD和RSD，结果显示重现性良好，见表2。

表2 芦丁标准曲线的重现性试验

2.4 稳定性试验

精密量取0.5，2.0，4.0mL芦丁对照品溶液和1.0mL供试品溶液各3份，分别置于10mL容量瓶中，芦丁对照品溶液和同一供试样品溶液在反应体系形成黄酮 －铝盐络合物后0，10，20，30，40，50，60，80，100，120min，按 “线性考察”项下方法测定其吸光度。结果显示在30min内稳定性良好，RSD＝0.12%，30min后吸光度逐渐下降且变化明显，提示测定宜在反应显色后30min内进行，本实验选择测定时间为反应显色后15min。同时吸取同一供试品溶液1.0mL分别在制备后0，1，2，3，4，6，8h，按 “线性考察”方法测定总黄酮含量，结果RSD＝1.84%，表明供试品溶液在8h内基本稳定，测定结果无显著变化。

2.5 加样回收率试验

精密量取5份已测定总黄酮含量的甘木通叶提取液供试品各1.0mL，置于10mL容量瓶中，依次加入芦丁对照品溶液 0.5，1.0，2.0，3.0，4.0mL，按 “线性考察”项下方法测定吸光度值，代入标准曲线方程计算加样回收率与RSD，结果见表3。

表3 芦丁加样回收试验

2.6 样品含量测定

取适量甘木通茎、叶，在40℃下烘干至恒重，粉碎，分别精确称取5.0g药材粉末放入烧瓶中，用适量石油醚加热回流直至无色，弃去石油醚提取液，于温水浴中挥干残留的石油醚，然后加100mL75%乙醇于90℃回流提取1h，过滤，残渣加100mL75%的乙醇继续提取3次，合并4次滤液减压浓缩，用醋酸乙酯萃取3次，萃取液回收醋酸乙酯后转移至100mL的容量瓶中，加75%乙醇定容即得供试品溶液。精密量取甘木通叶与茎的供试品溶液1.0mL（各3份）分别置于10mL容量瓶中，按 “线性考察”项下方法测定吸光度值，代入标准曲线方程计算叶、茎中总黄酮的平均含量，结果见表4。

表4 甘木通叶与茎的总黄酮含量

甘木通叶、茎中总黄酮含量分别为11.976mg·g－1（1.20%）与9.894mg·g－1（0.99%），尽管叶比茎的总黄酮含量高出约21%，但二者均可入药。

3 讨论

大量研究表明黄酮类化合物因具有扩张冠状动脉、降血压、降血脂、抑制血小板聚集、降低血管脆性、抗菌、抗癌等作用而引起人们的高度重视［2］。分析测定黄酮类化合物的方法有许多，而目前应用最广的方法仍是HPLC法和分光光度法。HPLC法具有分离效率高、分析速度快、检测灵敏度高等优点，但设备昂贵、操作要求高。采用反相HPLC法时由于黄酮类化合物未解离的羟基与固相作用较强而导致拖尾，加酸虽然可以克服拖尾现象，但是酸对仪器具有腐蚀性［3］。分光光度法根据黄酮类化合物与Al3＋络合显色的原理进行分析测定，所用设备简单、操作容易，特别适合测定总黄酮的含量［4-5］。

用甘木通药材生产制剂时是茎、叶混合提取，但甘木通确切的有效部位尚不明确，以甘木通中的有效成分黄酮类化合物为检测指标，本实验采用分光光度法测定甘木通叶与茎中总黄酮类化合物的含量分别为1.12%和0.99%，尽管叶中总黄酮含量比茎高出21%，但是比较接近，说明茎、叶均可入药，并可以混合在一起提取。此外，本实验的精密度试验和回收率试验均较好，在甘木通确切的有效成分尚不明确而缺乏质量控制标准的情况下，该方法暂可用于甘木通药材及其制剂的质量控制。

［1］傅锐斌，邱建，马俊，等.冠心康片治疗冠心病心绞痛临床疗效研究［J］.中药材，2005，28（11）：1045-1046.

［2］许实波，梅雪婷，许东晖，等.26种黄酮类天然活性成分的药理研究进展［J］.中药材，2003，26（1）：46-54.

［3］赵晓莉，岳红.黄酮类化合物分析方法概述［J］.盐湖研究，2005，13（2）：34-38.

［4］魏永生，王永宁，石玉平，等.分光光度法测定总黄酮含量的实验条件研究［J］.青海大学学报（自然科学版），2003，21（3）：61-63.

［5］邓桂春，王鑫，赵丽艳，等.分光光度法测定银杏叶中黄酮的含量［J］.辽宁大学学报，2005，32（2）：101-104.

Determ ination of Total Flavonoids Contents from Leaves and Stem of Clematis Filamentosa Dunn

Hu Zongli，Huang Xiaoping，Chen Junxia
（Yingdong School of Bioengineering，Shaoguan University，Shaoguan Guangdong 512005，China）

Objective：To determinate the contents of total flavonoids from leaves or stem of Clematis filamentosa Dunn.M ethods：The total flavonoids from Clematis filamentosa Dunn were extracted with 75%alcohol at 90℃.Taking rutin as comparison product to make standard curve，the content of flavonoids was determinated by spectrophotomerty with the detection wavelength of 510nm.Results：Regression equation was C＝0.090 244A－0.000 193 6（r＝1.000 0）.The linear concentration was in the range of 0.007 5～0.060mg·mL－1for rutin.The average recovery was 101.18%，RSD was 2.36% （n＝5）.The average contents of total flavonoids from leaves or stem of Clematis filamentosa Dunn were 1.20%and 0.99%respectively.Conclusion：The total flavonoids content from leaves of Clematis filamentosa Dunn was higher over 21%than one from their stem

Clematis filamentosa Dunn；Total flavonoids；Spectrophotomerty

*胡宗礼，E-mail：sgu-hu-zl＠shou.com

2009-10-20）