超声波预处理对大豆蛋白酶水解物抗氧化活性的影响

吴 瑕江连洲王晰锐王 鑫

(东北农业大学成栋学院1,哈尔滨 150030)

(东北农业大学食品学院2,哈尔滨 150030)

超声波预处理对大豆蛋白酶水解物抗氧化活性的影响

吴 瑕1江连洲2王晰锐2王 鑫2

(东北农业大学成栋学院1,哈尔滨 150030)

(东北农业大学食品学院2,哈尔滨 150030)

试验采用超声波法对大豆蛋白溶液进行预处理,再用碱性蛋白酶进行水解,通过大豆蛋白酶水解物的亚铁还原能力来确定超声波预处理的最佳工艺条件。结果表明,经超声波预处理大豆蛋白溶液最佳工艺条件为超声波功率:500 W,超声波处理时间:30 min,超声波处理温度:70℃。经超声波预处理的酶水解物抗氧化能力强于未经超声波处理的 5 h酶水解物且差异显著(P<0.05)。超声波预处理的酶水解物亚铁还原能力虽不及BHA(P<0.05),但明显强于抗坏血酸(P<0.05)。超声波预处理的酶水解物对 TBARS抑制效果和DPPH清除能力均强于未经超声波处理的 5 h酶水解物(P<0.05)。

超声波 预处理 抗氧化活性 大豆蛋白 酶水解物

大豆蛋白酶水解物氨基酸组成与大豆蛋白基本相同,其必需氨基酸平衡良好,含量丰富,具有许多优良的功能性质。目前已发现大豆蛋白酶水解物具有抗氧化、降血压、降胆固醇、降血糖、抗疲劳、抗癌、免疫等生理活性,其中抗氧化性是大豆肽其他生理功能的基础[1]。预处理大豆蛋白的目的:一是使蛋白质充分变性,二是使蛋白质尽可能多的打开二硫键、三是除去异味。预处理常采用物理方法和化学方法。物理方法有加热法、微波法、超声波法等。化学方法如加酸、加碱处理或添加化学试剂,可以大大提高酶解效果。但是化学方法易引入杂质,且有可能导致氨基酸受到一定程度的破坏,降低产品的营养价值,影响产品最终品质[2]。

本试验采用超声波法对大豆蛋白溶液进行预处理,再用碱性蛋白酶水解,以促进酶解进程,获得高活性的抗氧化多肽,通过大豆蛋白水解物的还原能力来确定超声波预处理的最佳工艺条件,同时对预处理影响酶水解物抗氧化活性的机理进行了探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

大豆分离蛋白:哈高科大豆食品有限责任公司;碱性蛋白酶:丹麦诺维信公司;大豆卵磷脂、抗坏血酸、丁基羟基茴香醚 (BHA)、三吡啶三吖嗪 (2,4,-Tris(2-pyridyl)-s-triazine,TPTZ)、二苯代苦味肼基自由基 (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,DP2 PH):Sigma公司;其他试剂均为分析纯。

SB25-12DTD超声波清洗器机:宁波新芝生物科技股份有限公司;XHF-D高速分散器:宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大豆蛋白酶水解物的制备

将大豆蛋白溶解后,调节溶液 pH值、温度至最适条件,加入碱性蛋白酶,反应过程中不断加入1 mol/L的NaOH,使 pH值保持恒定,记录耗碱量(mL),用于计算水解度 (degree of hydrolysis,DH),待水解结束后沸水浴 5 min使酶灭活,水解液用来测定抗氧化能力。

1.2.2 超声波预处理条件的确定

大豆蛋白溶液进行酶解以前,采用超声波清洗器机对其进行震荡处理。在超声频率为 20 kHz条件下,对超声功率、超声温度及超声时间进行正交优化,以水解物的亚铁还原能力为指标,确定最佳的超声处理条件。

1.2.3 水解度的测定

根据 pH-Stat法[3],水解度计算公式为 DH= h/htot

式中:h为单位质量蛋白质中被水解的肽键的量(mmol/g);htot为每克原料蛋白质中肽键的物质的量/mmol/g,对大豆分离蛋白,该值取 7.8。

1.2.4 亚铁还原能力的测定

参照 Benzie等[4]的方法。取 3.0 mL新配的FRAP(亚铁还原能力,Ferric Reducing Ability of Pow2 er)试剂(由 pH值为 3.6,浓度为 300 mmol/L醋酸盐缓冲液 25 mL,10 mmol/L的 TPTZ溶液2.5 mL和 20 mmol/L的 FeCl3·6H2O溶液 2.5 mL混合在一起组成)加热到 37℃,向其中加入 0.1 mL大豆蛋白水解物,0.3 mL的 H2O,室温反应 10 min,在 593 nm读取吸光度值。以 100～1000μmol/L的 FeSO4·7H2O制作标准曲线。样品抗氧化活性以达到同样吸光度所需的 FeSO4·7H2O物质的量表示。同时以未水解的大豆蛋白进行试验,采用BHA和抗坏血酸作为阳性对照。

1.2.5 脂肪氧化体系的制备

卵磷脂脂质体氧化体系 (soybean phosphatidylcholine liposome),采用 Decker等[5]的方法并进行一些改进。将大豆卵磷脂 (0.2 g/L)溶解在浓度为0.12mol/L的 KCl,5 mmol/L组氨酸缓冲溶液(pH值为 6.8)均质后,在 4℃进行超声波处理 45 min[6]。对照用 1 mL水代替 1 mL样品溶液与 5 mL的脂质体溶液混合,同时以未水解的大豆蛋白进行试验,以未水解蛋白作为阴性对照,以BHA和抗坏血酸作为阳性对照。脂质氧化由铁的氧化还原反应引发,将0.1 mL浓度为 50 mmol/L的 FeCl3和 0.1 mL浓度为10 mmol/L抗坏血酸盐加入脂质体氧化体系中。样品在 37℃水浴中保温 1 h,并迅速测定硫代巴比妥酸反应物 (Thiobarbituric acid-reactive substances, TBARS)值。

1.2.6 硫代巴比妥酸反应物质(TBARS)的测定

参照 Sinnhuber等[7]的方法,并作适当的修改。取1 mL样品加入 3 mL硫代巴比妥酸溶液、17 mL三氯乙酸 -盐酸溶液,混匀后,沸水浴中反应 30 min,冷却,取 5 mL样品加入等体积的氯仿,3 000 r/min下离心10 min,532 nm下读取吸光值。TBARS值以每升脂质氧化样品溶液中丙二醛的毫克数表示。

TBARS=(A532/Vs)×9.48

式中:A532nm为溶液的吸光值;Vs为样品的体积; 9.48为常量,与硫代巴比妥酸反应物的稀释倍数和摩尔消光系数有关。

1.2.7 对DPPH稳定自由基的清除

参照 Yen等[8]的方法。在反应管中加入1.0 mL浓度为 0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液,再加入4 mL的不同浓度的大豆蛋白水解液,混合均匀,黑暗下室温避光反应 30 min后在 517 nm处读取吸光度值,同时以未水解蛋白作为阴性对照,以BHA和抗坏血酸作为阳性对照。

清除率 =[1-(A1-A2)/A3]×100%

式中:A1为 4 mL水解液 +1 mL DPPH溶液反应后的吸光度;A2为 4 mL水解液 +1 mL乙醇的吸光度;A3为 4 mL乙醇 +1 mL DPPH溶液的吸光度。

1.2.8 统计分析

每个试验重复 3次,结果表示为平均数 ±SD。数据统计分析采用 SPSS软件进行,差异显著性(P< 0.05)分析使用 Turkey HSD程序,采用 Excel软件作图。

2 结果与分析

2.1 超声波预处理条件的优化

通过三因素三水平 L9(33)正交试验来完成,各因素和水平如下:

表 1 超声处理条件正交试验表L9(33)

以表 1中的因素水平条件进行预处理,对预处理后的大豆蛋白溶液再进行水解,试验设计及结果见表2。

表2 超声波预处理正交试验设计与结果

经极差分析得到各因素的主次顺序为功率 >时间 >温度。最优条件为超声波功率:500 W,超声波处理时间:30 min,超声波处理温度:70℃。

2.2 验证试验

采用最佳超声波预处理条件即超声波功率 500 W,超声波处理时间 30 min,超声波处理温度 70℃对大豆蛋白溶液进行预处理,然后进行碱性蛋白酶水解,测定水解液的亚铁还原能力,抑制卵磷脂脂质体氧化体系的能力,DPPH自由基清除能力。

2.2.1 超声波处理对水解度的影响

在底物质量浓度 50 mg/mL、加酶量 2%(E/S)、酶解温度 60℃、pH 8.0条件下,碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白,不同时间水解度见图 1,5 h水解物的水解度为 18.56%。经超声波处理的大豆蛋白溶液在相同条件下酶解,其水解度呈增加趋势,5 h水解物的水解度为 19.12%,与未经超声波处理相比差异不大。

图1 不同水解时间的水解度

2.2.2 超声波预处理对抗氧化活性的影响

经最佳超声波预处理工艺处理后得到的大豆蛋白酶水解物的亚铁还原能力、卵磷脂脂质体氧化体系抑制能力、DPPH自由基清除能力结果见图 2至图4。

图 2说明,随着时间的延长,经最佳超声波预处理工艺处理后得到的大豆蛋白酶水解物的还原能力强于未经超声波水解的。未经预处理的大豆蛋白酶水解物从 1 h到 5 h,还原能力从 662.13μmo/L增加到 823.38μmo/L;超声波预处理以后,水解物的还原能力从 928.38μmo/L增加到 1 062.13μmo/L,比未经预处理时分别提高 1.4倍和 1.3倍。

由图 3可以得出,大豆蛋白水解物 TBARS值随水解时间的延长呈下降趋势,即水解液对卵磷脂脂质氧化体系的抑制作用呈增强趋势。未经超声波预处理时,水解时间从 1 h到 5 h时,TBARS值由 3.74 mg/L降低到 2.74 mg/L;超声波预处理以后,TBARS值为由 3.69 mg/L降低到 2.69 mg/L,比未经预处理时分别降低 0.98倍。

由图 4可见,随着时间的增加,变化呈升高趋势。未经超声波预处理的 1 h水解物 DPPH自由基清除率为 48.47%,5 h水解物清除率达到 68.47%;经超声波预处理后 1 h水解物DPPH自由基清除率为 49.49%,5 h水解物清除率为 71.86%,比未经超声波处理时分别提高 1.02倍和 1.04倍。

综合比较经超声波预处理和未经预处理的水解物的亚铁还原能力,对卵磷脂脂质氧化体系的抑制作用和DPPH自由基清除能力可知,经超声波预处理后的大豆蛋白酶水解物抗氧化性得到提高。

2.2.3 超声波处理后水解物与常用抗氧化剂抗氧化活性比较

试验过程中,以未水解大豆蛋白作为阴性对照,以BHA和抗坏血酸作为阳性对照,得到大豆蛋白酶水解物与常用抗氧化剂抗氧化活性见表 3。

表 3 大豆蛋白水解物与常用抗氧化剂抗氧化活性的比较

由表 3可以看出,经超声波预处理的酶水解物抗氧化能力强于未经超声波处理的 5 h酶水解物且差异显著(P<0.05)。超声波预处理的酶水解物亚铁还原能力虽不及BHA(P<0.05),但明显强于抗坏血酸(P <0.05)。超声波预处理的酶水解物对 TBARS抑制效果和DPPH清除能力均强于未经超声波处理的 5 h酶水解物(P<0.05),与未水解的大豆蛋白和空白相比,其抗氧化效果有明显优势(P<0.05)。一定的功率下,超声波预处理底物,虽未导致水解度大幅度提高,由于引起大豆蛋白一些基团暴露,使构象发生变化,大豆蛋白酶水解物的抗氧化活性提高。也可能是因为超声波预处理使大豆蛋白内部抗氧化性氨基酸如组氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸等充分暴露出来,这些氨基酸对抗氧化肽活性和稳定性的提高具有重要的作用[7-9]。贾俊强等[10]从超声预处理的大米蛋白中制备抗氧化肽时,酶的使用量较未经超声波处理时用量低,并提出超声预处理不仅提高抗氧化肽的活性,也提高了抗氧化肽得率,提高了酶的使用效率。目前,“酶解 -膜分离耦合”技术已被广泛用于活性肽的制备[11],超声波预处理技术若与其结合使用可极大地降低酶使用量,提高酶解产量,这也是今后研究的重点。

3 结论

采用超声波法对大豆蛋白溶液进行预处理,再用碱性蛋白酶水解,以大豆蛋白水解物的还原能力来确定超声波预处理的最佳工艺条件为超声波功率:500 W,超声波处理时间:30 min,超声波处理温度:70℃。经此预处理条件得到的大豆蛋白酶水解物抗氧化活性比未经超声波预处理的酶水解物抗氧化活性强。经预处理后 5 h酶水解物亚铁还原能力为:1 062.13μmol/L,在脂质氧化体系中对 TBARS的抑制作用为 2.64 mg/L,DPPH自由基清除率为71.86%,水解度为 19.12%。

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Antioxidant Effect of Soybean Isolate Protein Enzymatic Hydrolysate Treated byUltrasonic

Wu Xia1Jiang Lianzhou2Wang Xirui2Wang Xin2
(Chengdong college,NortheastAgriculture University1,Harbin 150030)
(Food College,NortheastAgriculture University2,Harbin 150030)

Soybean protein was pretreated by ultrasonic first,then was hydrolysed by alcalase.The optimal con2 ditions of the ultrasonic treatmentwere obtained according to FRAP values.Results:The opti mal ultrasonic treatment conditions are ultrasonic power 500 W,treating for 30 min at 70℃.The antioxidant effect of the enzymatic hydroly2 sate after the ultrasonic pretreat ment is significantly enhanced.The FRAP value of the enzymatic hydrolysate after the ultrasonic pretreatment is stronger than ascorbic acid(P<0.05)whereas weaker than that of BHA(P<0.05).The TBARS value and scavenging rate forDPPH free radicalsof the enzymatic hydrolysate after ultrasonic pretreatment are all greater than those of the untreated(P<0.05).

ultrasonic,pretreatment,antioxidant effect,soybean protein,enzymatic hydrolysate

TS214.2 文献标识码:A 文章编号:1003-0174(2010)10-0032-05

863计划(2006AA10Z322)

2009-10-20

吴瑕,女,1978年出生,讲师,博士,粮食、油脂及植物蛋白工程

江连洲,男,1960年出生,教授,博士生导师,粮食、油脂及植物蛋白工程