柴胡栽培种ZQ-T干根药材的AFLP鉴别

郝媛媛,南晓洁,赵春贵＊,秦雪梅

柴胡栽培种ZQ-T干根药材的AFLP鉴别

郝媛媛1,南晓洁2,赵春贵1＊,秦雪梅1

(1.山西大学化学生物学与分子工程教育部重点实验室,山西太原030006; 2.山西省农科院农作物品种资源研究所,山西太原030031)

以干根药材为材料,采用AFLP技术进行了柴胡栽培种ZQ-T的鉴别.首先以3个柴胡栽培种干根样品混合DNA为模板进行AFLP分析,筛选出3对引物,经3次重复其DNA指纹图谱一致.然后以3对引物分别进行了7个栽培种的AFLP分析,每对引物均能从ZQ-T中扩增出特异条带,将ZQ-T鉴别出来;通过聚类分析,当遗传相似性系数分别为0.81、0.86、0.97时(引物分别为E-AAC/M-CTA、E-AGG/M-CTG和E-AGG/M-CAA)可将7个柴胡栽培种完全区分开.结果表明:AFLP可以较好地揭示柴胡种质资源的遗传差异,并可用于柴胡栽培种干根药材的鉴别.

柴胡;干根;AFLP;药材鉴别

0 引言

柴胡是我国传统常用中药,分布广泛,药用历史悠久.中药柴胡以根入药,具解表和里、退热、疏肝解郁等功效[1,2].《中国药典》(2005年版)收录柴胡(Bupleurum chinenseDC.)和狭叶柴胡(Bupleurum scorzonerif olium Willd.)干燥根为正品[3].目前柴胡野生资源濒临枯竭,在山西、甘肃、陕西等地出现了大面积的柴胡种植基地[4].在柴胡的栽培过程中形成了一些优良品种,经药效成分分析表明山西左权的种子(ZQ-T)品种优良[5],但该栽培种特别是其干根药材,仅通过传统的性状、显微及理化鉴别较难鉴别[6],因此探索干根药材鉴别的新方法具有重要意义.

分子标记技术的快速发展及广泛应用使得从DNA分子水平上鉴别中药成为可能,AFLP技术已广泛应用于中药的遗传多样性分析及品种鉴别等方面[7,8].目前已有关于柴胡ITS序列[9]及RAPD分析[10]等遗传多样性的研究,但供试样品大多是柴胡幼嫩组织,对柴胡进行AFLP分析尤其是对其药材干根的研究还少见报道.本研究以干根为材料,采用本实验室改良的CTAB法[11]提取样品干根DNA并进行了7个柴胡栽培种的AFLP分析,实现对山西左权种(ZQ-T)的鉴别,以期为柴胡药材的鉴别和优良栽培品种的选育提供方法和参考.

1 实验部分

1.1 材料和试剂

7个柴胡栽培种两年以上生干燥根,见表1(P292).聚乙烯吡咯烷酮(PVP K30)、尿素、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺,Sigma公司;限制性内切酶EcoRI、MseI,MBI;TaqDNA聚合酶、T4 DNA连接酶、剥离硅烷、亲和硅烷,北京鼎国生物公司;过硫酸铵,北京夏斯生物技术有限公司;AFLP接头和引物由北京奥科生物技术公司合成.

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取及酶切

每个样品均取30株柴胡干根,粉碎混匀取样,参照改良CTAB法提取样品DNA,以0.8%琼脂糖凝胶电泳检测.将样品DNA 37℃温育3 h,65℃温育3 h,80℃处理20 min,进行限制性内切酶EcoRI和MseI双酶切.

表1 用于AFLP分析的柴胡栽培种T able 1 Bupleurumcultivars used in AFLPanalysis

1.2.2 AFLP条件的优化

采用北京鼎国生物公司AFLP分析试剂盒,配合以6%聚丙烯酰胺凝胶电泳,进行银染检测[12,13].按照试剂盒使用说明书和Vos等方法[14],以3个柴胡干根样品(LX-T、ZQ-T、HC-T)混合DNA为模板进行AFLP条件的优化.

酶切DNA片段末段连接人工接头,16℃连接12 h,65℃加热10 min以灭活T4 DNA连接酶,4℃保存备用.连接产物稀释10倍为模板,以E-A和M-C作为引物,进行预扩增.将预扩增产物稀释20倍[15]为模板, E+3/M+3 64个引物组合分别为引物进行PCR扩增,以筛选选择性扩增引物.将预扩增产物分别稀释10倍、20倍、40倍、60倍和80倍作为模板,用筛选出的一对选择性引物进行PCR扩增,以优化选择性扩增模板的稀释倍数.以选择的模板稀释倍数和筛选出的选择性扩增引物,分别进行3次PCR重复扩增,以考察其重复稳定性.

1.2.3 柴胡AFLP指纹图谱的构建与聚类分析

在优化条件的基础上,采用AFLP方法分析了ZQ-T等7个柴胡栽培种.经6%聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染显色获得各栽培种的AFLP指纹图谱.在相同迁移位置有DNA条带记为“1”,无条带则记为“0”,用NTSYS-PC (2.10)软件按UPGMA法进行聚类分析,获得柴胡栽培种聚类图[16,17].

2 结果与分析

2.1 模板DNA的检测及酶切

干根样品DNA及酶切片断经琼脂糖凝胶电泳检测,结果如图1所示.从7个柴胡栽培种干根样品中提取的DNA,电泳条带明亮清晰,经EcoR I/MseI双酶切后,酶切充分,表明DNA纯度较高,可用于后续实验.

图1 柴胡干根样品DNA的提取(a)和EcoRI和MseI双酶切(b)Fig.1 Extraction and enzyme digestion of DNA samples fromBupleurumcultivars

2.2 AFLP条件的优化

2.2.1 选择性引物的选择

以AFLP分析试剂盒提供的E+3/M+3组合而成的64对引物进行引物筛选,结果见图2(P293),多对引物能够产生扩增条带,其中E-AAC/M-CTA、E-AGG/M-CTG、E-AGG/M-CAA 3对引物DNA扩增条带丰富,带型质量较好,分辨率较高.

2.2.2 扩增模板浓度的选择

以预扩增产物稀释不同倍数作为模板,E-AAC/M-CTA为引物进行选择性扩增.结果表明稀释倍数在20～80倍范围内均可得到清晰的AFLP指纹图谱.

2.2.3 重复性测定

分别以E-AAC/M-CTA、E-AGG/M-CTG、E-AGG/M-CAA为引物,预扩增产物稀释80倍作为模板对3个柴胡样品混合物重复进行3次AFLP分析,3对引物3次扩增均获得一致的AFLP指纹图谱,重复性良好.

图2 E+3/M+3组合64对引物的AFLP指纹图谱Fig.2 AFLP fingerprinting by E+3/M+3 64 primer pairs

2.3 AFLP指纹图谱的分析

分别以E-AAC/M-CTA、E-AGG/M-CTG和E-AGG/M-CAA为引物,对7个柴胡栽培种干根样品进行了AFLP分析,见图3.各个柴胡栽培种的AFLP指纹图谱扩增条带丰富,带型清晰稳定,其中ZQ-T分别用3对引物扩增出27、25、17条带,每对引物都可扩增出其特异条带,虽然不同引物获得的特异性条带数量和位置不同,但均能将ZQ-T从7个栽培种中鉴别出来(表2).

表2 柴胡栽培种ZQ-T的AFLP指纹图谱条带分析T able 2 B ands analysis of AFLP fingerprinting forBupleurumcultivar ZQ-T

2.4 聚类分析

7个柴胡栽培种的遗传关系聚类图,见图3(P294).6号和7号(即XC-T和XC-L)样品属于不同栽培地的2个狭叶柴胡栽培种,其它为不同栽培地的5个北柴胡栽培种,通过聚类分析3对引物获得了相似但不完全相同的聚类图.北柴胡5个栽培种首先聚为一类,而狭叶柴胡2个栽培种聚为一类,然后二者再聚在一起,与分类学结果相一致,表明种间差异大于种内差异.5个北柴胡栽培种虽然聚为一类,但3对引物获得的聚类以及两两之间的遗传相似性系数并不完全一致,表明每一对引物所反映的不是全部而是部分遗传信息,况且不同引物所分析的位点和数目也不尽相同,因而其聚类存在有差别.

通过聚类分析,7个栽培种之间的遗传相似性系数不同,不但可以将ZQ-T鉴别出来,而且原产地相同,栽培地不同的北柴胡样品SL-L与SL-T、LX-T与LX-L也能够相互区分开.当遗传相似性系数分别为0.81、0.86、0.97(引物分别为E-AAC/M-CTA、E-AGG/M-CTG、E-AGG/M-CAA)时,能够将7个栽培种完全区分开,其中引物E-AAC/M-CTA的鉴别效率最高.表明此方法可用于种及种下的鉴别,并可以较好地揭示柴胡种质资源的遗传差异.

3 讨论

AFLP分析方法稳定可靠,分辨率高,多态性强,检测效率高,已广泛应用于中药的遗传多样性分析及品种鉴别等方面.本文以柴胡栽培种干根药材为材料,在扩增模板浓度的选择、引物筛选和重复性试验的基础上,构建了7个柴胡栽培种的AFLP指纹图谱,能够有效区分出优良品种ZQ-T及不同的柴胡栽培种.这表明AFLP可以较好地揭示柴胡种质资源的遗传差异,可用于柴胡栽培种干根药材的鉴别.我国柴胡资源丰富,已报道柴胡43种,17变种,7变型[2],还有不同的居群和不同的药材栽培种,要实现对它们的系统研究非常困难.本研究仅使用3对引物构建了7个柴胡栽培种的AFLP指纹图谱,建立了一个利用AFLP技术进行柴胡优良品种鉴别的方法.随着研究品种和所用引物数量的增加,得到的结果会更加准确,可构建出柴胡的标准指纹图谱库,就能对柴胡不同种及不同栽培种进行鉴别.

总之,本研究以鉴别优良柴胡栽培种干根药材为目的,筛选到3对引物,建立了柴胡不同栽培种干根AFLP分析方法,从分子水平上对柴胡优良栽培种进行了鉴别,结果反映出不同柴胡栽培种之间的亲缘关系,对于柴胡干根药材鉴别以及优良品种的选育有积极意义.

图3 柴胡栽培种3对引物的AFLP指纹图谱及聚类分析Fig.3 AFLP fingerprinting of theBupleurumcultivars by 3 primer pairs and dendrogram of cluster

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Identification on the Medicinal Dried Roots from BupleurumCultivar ZQ-T by AFLP T echnique

HAO Yuan-yuan1,NAN Xiao-jie2,ZHAO Chun-gui1,QIN Xue-mei1
(1.Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering of Ministry of Education, Shanxi University,Taiyuan030006,China; 2.Institution of Crop Germplasim Resources,Shanxi A gricultrue Academy of Science,Taiyuan030031,China)

TheBupleurumcultivar ZQ-T was identificated by AFLP,with the medicinal dried roots as material.3 AFLP primer pairs was screened based on the DNA admixture templates from dried roots of 3Bupleurumcultivars,and the fingerprintings were accordant after amplifying 3 times using each primer pairs.Moreover,7Bupleurumcultivars were analyzed using the 3 primer pairs,respectively.ZQ-T was be distinguished from others because it owned some specific bands on its DNA fingerprintings.On the basis of clustering analysis,the 7 samples of cultivars were divided into 7 clusters when the genetic similarity coefficients were 0.81,0.86 and 0.97,respectively using primer pairs E-AAC/M-CTA,E-AGG/M-CTGand E-AGG/M-CAA,so that all of the 7 medicinal dried root samples of cultivars was distinguished.The results showed that AFLP can be used to study genetic diversity ofBupleurumand identification of medicinal dried root samples fromBupleurumcultivars.

Bupleurum;Dried root;AFLP;medicinal materials identification

R282

A

0253-2395(2010)02-0291-05

2009-07-28;

2009-09-14

国家自然科学基金(30570174)

郝媛媛(1984-),女,山西介休人,硕士研究生,从事生物化学与分子生物学研究.＊通讯联系人:E-mail:chungui@ sxu.edu.cn