铁蛋白重链多肽对RAW264.7细胞中凋亡相关基因表达的影响

杜军伟,王远志,陈创夫,葛阳春

(1石河子大学动物科技学院,石河子832003;2新疆民族与地方高发病教育部重点实验室,石河子832003)

铁蛋白重链多肽对RAW264.7细胞中凋亡相关基因表达的影响

杜军伟1,2,王远志2,陈创夫2,葛阳春1,2

(1石河子大学动物科技学院,石河子832003;2新疆民族与地方高发病教育部重点实验室,石河子832003)

为了探讨铁蛋白重链多肽(ferritin heavy chain 1,FTH1)对RAW264.7细胞中凋亡相关基因表达的影响,采用RNA干扰和实时定量方法进行研究,首先提取RAW264.7细胞的总RNA,应用反转录PCR获得定量片段,制定标准曲线。将pSIREN-FTH1A/B转染到RAW264.7细胞,48 h后用绵羊种布鲁氏菌019株侵染4 h,实时定量PCR检测凋亡相关基因Mkl1、Birclb的表达,GAPDH作为内参基因,检测干扰前后凋亡相关基因mRNA的量。结果显示:转染pSIREN-FTH1的细胞被布鲁氏菌侵染后,Mkl1、Birclb基因mRNA的量较干扰前分别降低了76.3%、88.8%。FTH1可调节凋亡相关基因表达从而影响细胞凋亡的进程。

布鲁氏菌;巨噬细胞;FTH1;凋亡

Abstract:To investigate the effects of ferritin heavy chain 1(FTH1)on the transcription of apoptosis-related genes Mkl1 and Birclb in mouse macrophage cells RAW264.7.The research was carried out by means of RNAi and RT-PCR.The total mRNA was extracted.The apoptosis-related genes were aquired by RTPCR,then made standard curves of them.pSIREN-FTH1A/B was transfected into a mouse RAW264.7 macrophages.After 48 h the transfected cells were infected for 4 h by B.ovis 019 strain.The expressions of apoptosis-related genes were quantitated and compared by real-time PCR on the basis of expressions of g1yceraJdehyde-3-phosphate dehdrogenase(GAPDH)as internal control in different groups.The results showed that the pSIREN-FTH1 group could significantly inhibited Mkl1 and Birclb mRNA expressions in mouse RAW264.7 macrophages infected with B.ovis 019 strain.The inhibition rate reached to 76.3%and 88.8%,respectively.FTH1 participate apoptosis of RAW264.7 macrophages cells by regulating the transcription of Mkll and Birclb.

Key words:Brucella;macrophage;FTH1;apoptosis

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌属(Brucella)成员引起的一种慢性人畜共患传染病,其病原为布鲁氏菌,是一种兼性细胞内寄生的致病菌,主要感染反刍动物和人类[1-3]。

近年来,畜牧业的快速发展促使牲畜调运频繁,而家畜的布鲁氏菌病的阳性率呈逐年上升趋势。为了更好的预防布鲁氏菌病,唐利燕等[4]建立了和M5-90疫苗株bp26基因缺失苗的配套性血清学检测方法bp26间接ELISA法。布鲁氏菌与巨噬细胞间胞内寄生关系对于慢性布鲁氏菌感染至关重要,由VirB编码的IV型分泌系统对于胞内布鲁氏菌的成功复制是必需的[5]。毒力较强的光滑型的布鲁氏菌可以抑制巨噬细胞的凋亡[6]。王远志等[7]应用酵母双杂交技术筛选出了和布鲁氏菌IV型分泌系统相作用的铁蛋白重链多肽(ferritin heavy chain 1,FTH1)。铁蛋白有保护细胞免受氧化损伤的作用[8],而氧化损伤是导致细胞凋亡的因素之一[9]。

本试验通过运用RNA干扰技术下调FTH1的表达,并运用荧光实时定量技术来检测干扰后巨噬细胞中相关凋亡基因的mRNA表达量,从而检测FTH1在绵羊种布鲁氏菌侵染巨噬细胞过程中是否参与了巨噬细胞的凋亡过程。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料及主要仪器

pSIREN-siRNA表达质粒(pSIREN-FTH1A/B)由本实验室保存;小鼠RAW264.7巨噬细胞株购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库;宿主菌DH5a由本实验室保存;B.ovis 019株由本实验室保存;LSM510激光共聚焦显微镜:新疆地方与民族高发病教育部重点实验室;Smart CyclerⅡ实时定量PCR仪:Cepheid公司。

1.1.2 主要试剂

PrimeScript TM RT reagent Kit购自大连生物工程有限公司;DMEM培养基、小牛血清购自 G IBCO公司;TurboFect TM in vitro Transfection Reagent转染试剂盒、Trizol购自 I nvitrogen公司;荧光定量PCR试剂盒购自博奥公司;无内毒素质粒大提试剂盒购自天根生化科技有限公司;其他试剂为国产分析纯产品。

1.2 方法

1.2.1 设计实时定量引物

根据从 G enBank中获得的下列基因编码序列,设计实时定量引物(表1)。

实时定量引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 引物序列Tab.1 Primers sequence

1.2.2 细胞总RNA提取

收集在细胞培养板上生长达到70%的细胞1 mL至离心管,用冷的DEPC水洗2次。

向离心管中加入1 mL TRIzol,吹打数次,室温静置5 min,离心,取上清至另一离心管中。

向离心管中加入0.2 mL的氯仿,颠倒15 s,室温静置5 min,液体出现分层。4℃,1.2×104r/min离心15 min,液体分层。

吸取上层水相约0.5 mL置另一离心管中,加入等体积的异丙醇,混匀,-20℃静置60 min。

4 ℃,1.2×104r/min离心15 min,弃上清,并吸干离心管中的残液。

向离心管中加入预冷的75%的乙醇1 mL,轻弹管壁,4℃,1.2×104r/min离心15 min,弃上清。

将离心管空气干燥10 min,加20μL DEPC水溶解RNA,取5μL用1%的变性琼脂糖电泳检测。

进行反转录PCR获得cDNA。

1.2.3 制定实时定量标准曲线

本试验选取 GAPDH作为内标基因,分别对Mkl1、Birclb、16S rRNA、GAPDH 质粒从10-1-10-7按10倍梯度稀释后进行定量PCR反应制作标准曲线。

1.2.4 转染pSIREN-FTH1A/B质粒

小鼠巨噬细胞RAW264.7用含10%小牛血清DMEM培养基,将处于对数生长期的细胞置于12孔细胞板中,在37℃5%CO2条件下培养24 h后,用TurboFect TM in vitro Transfection Reagent转染试剂按说明书进行转染,试验将pSIREN-FTH1B转染组设为阴性对照组。然后5%CO237℃条件下培养48 h,用LSM510激光共聚焦显微镜观察细胞中的绿色荧光表达蛋白。

1.2.5 B.ovis 019株侵染RAW264.7巨噬细胞

B.ovis 019株侵染小鼠巨噬细胞。细胞按50∶1的个数比进行侵染细胞,并将侵染的RAW264.7细胞继续置于5%CO237℃的CO2培养箱中侵染4 h。轻轻吸去培养板中的上清及悬浮细胞,加入1 mL Trizol,轻轻混匀,分装于DEPC处理过的1.5 mL EP管中,其它步骤同1.2.2。

1.2.6 实时定量检测凋亡相关基因

实时定量PCR检测转入干扰质粒再用布鲁氏菌侵染后 ,细胞中 Mkl1、Birclb、16S rRNA、GAPDH mRNA的量,将结果进行统计学分析。

2 结果

2.1 细胞总RNA提取

提取RAW264.7巨噬细胞总RNA,1%的变性琼脂糖电泳检测可以清楚的看到28 S、18 S和5.8 S三条带(图1)。

图1 总RNA提取Fig.1 Total RNA isolated

2.2 实时定量标准曲线的制作

Birclb、Mkl1、16S rRNA、GAPDH 的 标准曲线方程斜率分别为 - 0.321、-0.251、-0.228和-0.22,相关系数分别为 0 .999、0.992、0.997 和0.996,符合作为标准曲线的要求(图2)。

图2 凋亡相关基因标准曲线和扩增曲线Fig.2 Standard and amplification curve of apoptosis-related genes

2.3 转染RNAi质粒在细胞中的表达

用TurboFect TM in vitro Transfection Reagent转染试剂盒的操作说明进行转染,在48 h后用LSM510激光共聚焦显微镜观察巨噬细胞中的绿色荧光表达蛋白,经多处采集信息计算出质粒的转染效率接近于100%(图3)。

2.4 荧光实时定量检测凋亡相关基因

实时定量PCR检测干扰前后被布鲁氏菌侵染的 R AW264.7 细胞中 M kl1、Birclb、16S rRNA、GAPDH的 m RNA量,以相应目标基因检测值/GAPDH的检测值作为校正值,再用公式干扰效率/%=(RNAi阴性对照组 - RNAi试验组)/RNAi阴性对照组×100%,计算FTH1被干扰前后各个基因在布鲁氏菌侵染过程中的差异:Mkl1的相对表达量降低约76.3%,Birclb的相对表达量降低约88.8%,16S rRNA的相对表达量降低约73%。

图3 RAW264.7细胞转染pSIREN-siRNA表达质粒48 h后的荧光照片Fig.3 The fluorescence of RAW264.7 cells transfected with pSIREN-siRNA expression plasmids

3 讨论

布鲁氏菌长期胞内寄生机制一直是研究者关注的热点之一。Jimenez等[10]的研究表明,布鲁氏菌胞内寄生时新合成某些蛋白抑制了巨噬细胞的凋亡,从而避免巨噬细胞死亡崩解后,使布鲁氏菌再次面对机体体液免疫和细胞免疫的不利环境,从而保护布鲁氏菌在巨噬细胞内的长期寄生,使其成为慢性感染的重要原因之一。He等[11]的研究结果表明,在感染4h时,cd28和Gsn基因表达上调,Bc031407基因表达下调。由 Gsn编码 Gesolin通过诱导抗 Fas抗体、C2-cermide等产生抑制细胞凋亡。新疆源布鲁氏菌各个种之间的热休克蛋白具有很强的保守性,该蛋白的高表达对细胞凋亡和坏死也有抑制作用[12]。

铁蛋白具有调整铁的贮存和维持细胞内铁的内环境稳定的功能。细菌致病期间也需要铁,尤其是细胞内病原体,体内外实验表明缺失铁会严重降低结核分枝杆菌、热柯克斯体、嗜肺军团菌、鼠伤寒沙门菌及其他胞内菌的致病性[13]。铁蛋白由重链和轻链组成,Tsuji等[14-15]证实铁蛋白重链转录起始位点的上游有抗氧化反应元件,该亚基具有亚铁氧化酶作用,催化Fe2+氧化成 Fe3+,保护细胞免受氧化损伤,铁蛋白重链是细胞内抗氧化剂之一。所有的铁蛋白都可以在有氧条件下与溶液中的二价铁离子反应,铁离子螯合在内部的空心结构中,抑制二价铁离子氧化反应,从而保护细胞不受铁离子过量引起的氧化损害,而且亚铁氧化中心能利用芬顿反应的反应物阻止自由基的产生,所以认为铁蛋白在抑制铁离子的氧化损伤中具有重要作用[16]。活化核转录因子NF-кB等,加速凋亡相关基因表达是氧化损伤引起细胞凋亡的可能机制之一[17]。

本研究通过转染干扰质粒干扰FTH1的表达,通过实时定量检测到16S rRNA的相对表达量降低约73%,Mkl1的相对表达量降低约76.3%,Birclb的相对表达量降低约88.8%。有资料显示Mkl1、Birclb是细胞中的凋亡抑制因子[11],据此推测:当FTH1被干扰以后,Mkl1、Birclb的表达量随之降低,那么细胞的凋亡速度就会相应的增快,布鲁氏菌造成的抑制巨噬细胞凋亡的程度也会相对的减弱。本研究可为以后研制抗布鲁氏菌药物提供理论参考。

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Effect of Ferritin Heavy Chain 1 on the Expression of Apoptosis-Related Genes in Mouse RAW264.7 Macrophage Cells

DU Junwei1,2,WANG Yuanzhi2,CHEN Chuangfu2,GE Yangchun1,2
(1 College of Animal Science and Technology,Shihezi University,Shihezi 832003,China;2 Ministry of Education Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Disease,Shihezi 832003,China)

S852.614;R378.5

A

1007-7383(2010)05-0565-04

2009-04-06

国家自然科学基金(30800813),新疆兵团博士基金(2009JC15),国家重点基础研究发展计划(973)项目(2010CB530200)

杜军伟(1984-),女,硕士生,专业方向为畜禽病原分子生物学。

王远志(1977-),男,副教授,从事免疫遗传与抗病机制研究;e-mail:wyzshz@sina.com。