天津市污水以及再生水处理过程中的雌/孕激素干扰效应

庄丽丽，马梅，饶凯锋，王东红，陈玉成

1.西南大学资源环境学院，重庆400715

2.中国科学院生态环境研究中心环境水质学国家重点实验室，北京100085

天津市污水以及再生水处理过程中的雌/孕激素干扰效应

庄丽丽1，2，马梅2，*，饶凯锋2，王东红2，陈玉成1

1.西南大学资源环境学院，重庆400715

2.中国科学院生态环境研究中心环境水质学国家重点实验室，北京100085

应用重组基因酵母检测了天津市4个污水处理厂以及2个再生水厂13个水样的雌/孕激素干扰效应.其中3个污水处理厂的进水检出了雌激素诱导活性，最高检测值为10.7ngEEQ·L-1；所有水样均未检测出孕激素诱导活性，但都检测出不同程度的孕激素抑制活性，其中检出了雌激素诱导活性的污水处理厂的进水具有相对较强的孕激素抑制活性.4个污水处理厂均不能完全去除孕激素抑制活性物质，去除率在44%～78%之间.微滤和臭氧氧化两种工艺结合对孕激素抑制活性物质的去除效率略优于MBR反应器.2个再生水厂出水加氯后孕激素抑制活性均有所增强.关键词：重组基因酵母；污水处理厂；再生水厂；雌激素；孕激素

1 引言（Introduction）

雌/孕激素干扰物是两种重要的内分泌干扰物质（Endocrine Disrupting Chemicals,EDCs），近年来，在河流、湖泊、海洋等天然水体中均检测出不同浓度的雌/孕激素干扰物，而城市污水处理厂以及再生水厂被认为是这两种内分泌干扰物的重要来源之一（王晓祎等，2009）.因此，检测城市污水处理厂及再生水厂水体中的雌/孕激素干扰效应，并对水厂不同处理段工艺进行评价，对预防大量内分泌干扰物进入环境具有重要意义.

重组激素受体基因酵母测试方法是目前世界各国普遍采用的定量检测环境激素效应的有效方法之一.当酵母与环境样品暴露后，酵母中的激素受体基因被具有相应激素活性的物质激活，从而在蛋白质转录和合成过程中报道基因也同时被激活，转录成β-半乳糖苷酶，通过测定β-半乳糖苷酶的活性可检测出环境样品的类激素活性（李剑等，2008）.本文应用重组人雌激素受体（hER）基因酵母以及重组人孕激素受体（hPR）基因酵母对天津市4个污水处理厂以及2个再生水厂不同工艺段的水样进行了雌/孕激素干扰效应的检测，以期对我国北方重要城市水厂的内分泌干扰效应有一个初步的了解.

2 材料与方法（Materials and methods）

2.1 样品采集和前处理

2009年7 月采集4个污水处理厂（A、B、C、D）以及2个再生水厂（E、F）的13个水样各4L，水样及其编号如下：A-I：A厂进水；A-E：A厂出水；BI：B厂进水；B-E：B厂出水；C-I：C厂进水；C-E：C厂出水；D-I：D厂进水；E-I：E厂进水；E-O：E厂臭氧氧化后的出水；E-Cl：E厂加氯后出水；F-I：F厂进水；F-M：F厂经膜生物反应器（MBR）后的出水；F-Cl：F厂加氯后出水.其中，E厂进水即D厂出水（E-I=D-E）.再生水厂（E、F）的主要工艺如图1所示.

图1 再生水厂E和F的主要工艺及采样点Fig.1Main technology and sampling points of reclaimed water plants

水样前处理方法参考文献（李娜等，2007;骆坚平等，2006）进行，水样经玻璃纤维素膜（APFF，MILLIPORE，USA）过滤后用HLB柱（500mg，OASIS，USA）富集.以5mL的甲醇/水（甲醇%=5%）清洗HLB柱，然后分别以5mL正已烷/二氯甲烷（体积比为1:1）和10mL甲醇/二氯甲烷（体积比为1:9）为淋洗剂洗脱，合并洗脱液进行旋蒸，高纯氮气吹干后用DMSO定容.

2.2 重组基因酵母检测法

重组人雌激素受体（hER）基因酵母为本实验室自行构建（李剑等，2008），培养基为SD/-Trp/-Leu营养缺陷型培养基.重组人孕激素受体（hPR）基因酵母由Gaido教授赠送，培养基为补充CuSO4、腺嘌呤、赖氨酸、色氨酸的SC培养基（李剑，2006a）.酵母添加15%甘油后以1mL分装于EP管中，-80℃保存，培养基于4℃保存（陈月华等，2010）.

酵母测试方法参考文献（李剑等，2006b）.取1mL新鲜冻融的酵母接种到30mL培养基中，30℃、150rpm培养24h，分光光度计检测600nm处的吸光度（OD600），培养基稀释菌液使其OD600为0.75.检测诱导效应时，取995μL酵母菌液和5μL样品混匀；检测抑制效应时，取990μL酵母菌液、5μL样品以及5μL阳性对照混匀，检测雌激素效应阳性对照为雌二醇（E2，2×10-10mol·L-1），检测孕激素效应阳性对照为孕酮（PG，1×10-9mol·L-1）.然后取200μL混合液于96孔板中，恒温平板摇床（Titramax 1000，Heidolph，Germany）30℃、800rpm暴露培养2h.以上均为无菌操作.酶标仪（TECAN A-5082，Austria）测定OD595，从96孔板中吸去150μL菌液，加入120μL分析缓冲液（每100mL基础缓冲液加入3.33mL浓度为0.1%的SDS溶液和270μL的β-巯基乙醇；基础缓冲液：21.51g的Na2HPO4·12H2O、6.22g的NaH2PO4·12H2O、0.75g的KCl和0.25g的MgSO4·7H2O溶于1L的超纯水中），平板摇床上预培养10min后加入20μL三氯甲烷1200rpm破碎细胞10min.然后加入40μL反应底物（ONPG，4mg·mL-1，溶于基础缓冲液）启动酶反应，反应完成后加入100μL浓度为1mol·L-1的碳酸钠溶液固定反应.吸取200μL到酶标板中测定OD420.为保证实验数据的可靠性，所有样品均3次重复.

为避免样品对酵母产生细胞毒性作用而出现假阳性或假阴性的结果，在酵母与样品暴露2h后，比较样品与阴性对照（DMSO代替待测样品）的OD595，若存在显著差异，说明样品对酵母有细胞毒性作用.

2.3 数据分析

β-半乳糖苷酶活性u值的计算：

式中，u为β-半乳糖苷酶活性（U）；OD′420为阴性对照在420nm处的吸光度值；OD420和OD595为样品在420nm和595nm处的吸光度值；V为测试用的菌液体积（mL）；t为反应时间（min）；D为稀释因子.

样品的激素干扰效应用抑制率以及诱导率来表征：

式中，u（s）为样品诱导酵母产生的酶活性；u（p）为阳性对照（E2、PG）诱导酵母产生的酶活性（陈月华等，2010）.

3 结果与分析（Results and analysis）

3.1 样品雌激素干扰效应检测

3.1.1 E2对重组雌激素受体基因酵母酶活性诱导的剂量-效应关系

本实验室以往研究已证明本实验所用的重组人雌激素受体基因酵母对E2有专一性的结合（李剑等，2008）.

将酵母暴露到不同浓度的E2溶液中，检测诱导产生的酶活性，建立E2对酶活性诱导的剂量-效应关系曲线（图2）.结果表明，重组雌激素基因酵母对E2有较高的灵敏度，EC50值为7.6×10-11mol·L-1，与本实验室以往报道结果一致（李剑等，2008）.

3.1.2 样品的雌激素受体诱导效应检测

应用重组雌激素受体基因酵母对全部13个水样进行雌激素诱导效应检测，结果如表1，污水处理厂A、C、D的进水检出了雌激素诱导活性，E2当量值（EEQ）分别为10.7、3.0和9.9ng·L-1，其它水样均未检出雌激素诱导活性.

图2 E2对重组雌激素受体基因酵母酶活性诱导的剂量-效应关系曲线Fig.2The induction dose response curve of recombinant human estrogen（hER）gene yeast induced by E2

表1 污水处理厂以及再生水厂水样的雌激素诱导活性Table 1Estrogen inductive activity of all water samples from sewage and reclaimed water plant

表2为国内外其它研究对于污水处理厂进出水雌激素诱导活性的检测结果.可以看出，本研究所检出的进出水雌激素诱导活性在所列研究中处于较低水平.

表2 国内外不同污水处理厂进出水雌激素诱导活性比较Table 2Comparison of estrogen inductive activity of influents and effluents of different waste water treatment plants at home and abroad

3.2 样品孕激素干扰效应检测

3.2.1 PG对重组孕激素受体基因酵母酶活性诱导的剂量-效应关系

本实验室以往研究已证明本实验所用的重组人孕激素基因酵母对PG有专一性的结合（李剑等，2006a;2006b）.

将酵母暴露到不同浓度的PG溶液中，检测诱导产生的酶活性，建立PG对酶活性诱导的剂量-效应关系曲线（图3）.结果表明，重组孕激素基因酵母对PG有较高的灵敏度，EC50值为1.2×10-9mol·L-1，与本实验室以往报道结果类似（李剑等，2006a;2006b）.

图3 PG对重组孕激素受体基因酵母酶活性诱导的剂量-效应关系曲线Fig.3The induction dose response curve of recombinant human progesterone（hPR）gene yeast induced by PG

3.2.2 样品的孕激素受体诱导效应检测

应用重组孕激素受体基因酵母对全部13个水样进行孕激素诱导效应检测，结果见图4，所有水样均未检出对孕激素受体酵母的诱导活性（诱导率低于10%认为无诱导活性）.

3.2.3 4个污水处理厂水样的孕激素受体抑制效应检测

应用重组孕激素受体基因酵母检测4个污水处理厂进水和出水共8个水样的孕激素抑制效应，结果如图5所示，污水处理厂A和D的污水总进水表现出较强的孕激素抑制活性，抑制率高达89.8%和84.7%，污水处理厂B和C的污水总进水孕激素抑制率也达到56.7%和53.1%.

图4 污水及再生水厂水样对孕激素酵母酶活性的诱导率Fig.4Inductivity of PR activity of all water samples from sewage and reclaimed water plants

图5 污水处理厂进出水对孕激素酵母酶活性的抑制率Fig.5Inhibition of PR activity of influents and effluents of sewage treatment plants

污水处理厂A的服务区域经济以工业为主，农业为辅，包括大型农业生产基地，该水厂主要承接工业废水及农业废水.农业中大量使用的农药如DDT、硫丹、林丹等是典型的具有孕激素抑制活性的化合物（Mckinlay et al.,2008;Marie et al.,2004）.此外，工业废水中也含有较多的孕激素抑制活性物质，如Chatterjee等（2008）对皮革制造业的水样检测中发现了大量具有孕激素抑制活性的化合物.该水厂承接大量含有上述化合物的污水可能是导致其进水具有较强孕激素抑制活性的主要原因.污水处理厂D的服务区人口密集，为该市商贸、金融、医疗中心，包括较为发达的工业区，该水厂承接污水来源广泛，导致进水孕激素受体抑制活性较强.

有研究证明，环境内分泌干扰物对生物体内孕激素受体表达的抑制可使雌激素受体的表达增强，从而表现出类雌激素效应（Kraus et al.,1995）.如李剑等人对酚类物质以及有机氯农药的内分泌干扰效应检测中发现，4-t-OP（4-t-辛基酚）、3,4-DCP（3,4-二氯酚）、PCP（五氯酚）、4-Phenylphenol（4-苯基苯酚）、P,P′-DDE和P,P′-DDT等化合物同时具有孕激素受体抑制活性和雌激素受体诱导活性，且在相对较低浓度下即表现出孕激素受体抑制活性，当化合物浓度增大1到4个数量级时，表现出雌激素受体诱导活性（Li et al.,2008;2009）.此外，某些内分泌干扰物如2-tertbutylphenol（2-t-丁基酚）、2-Isopropylphenol（2-异丙基酚）以及r-HCH等只具有孕激素受体抑制活性而不具有雌激素受体诱导活性（Li et al.,2008;2009）.可能由于上述化合物在污水中的广泛存在，使具有相对较强孕激素受体抑制活性的污水处理厂A、C、D的进水检出了雌激素受体诱导活性，而污水处理厂B的进水虽检出较强孕激素受体抑制活性但未检出雌激素诱导活性（表1和图5）.

污水处理厂A、B、C、D对于具有孕激素抑制活性化合物的去除率（（进水抑制率-出水抑制率）/进水抑制率×100%）分别为75.5%、63.0%、77.8%和43.6%，除污水处理厂D外，其余水厂去除效果均较好，出水抑制率降至22%以下.所有污水厂对孕激素抑制剂均不能完全去除.

3.2.4 两个再生水厂水样的孕激素受体抑制效应比较

图6显示两个再生水厂不同处理段对重组孕激素酵母酶活性的抑制率.由图6可见，水样在加氯前孕激素酵母活性抑制率显著下降；而加氯后出水孕激素酵母活性抑制率又显著升高.

图6 再生水厂不同处理段对孕激素酵母酶活性的抑制率Fig.6Inhibition ratios of PR activity of reclaimed water plants samples

再生水厂E主要采用“混凝-沉淀+微滤+臭氧氧化+氯气消毒”的处理工艺.常规的“混凝-沉淀”可较好地去除大分子有机物以及非溶解性色度（余国忠和栗印环，2002）.微滤膜主要截留污水中的颗粒物、细菌以及大分子有机物，而大量溶剂、小分子以及部分大分子有机物则能透过微滤膜.一般来说，内分泌干扰物这类小分子有机物可以通过微滤膜而不被截留，但某些内分泌干扰物为疏水性化合物，可由吸附作用附着在膜的表面，从而达到分离的目的（Yoon et al.,2004）.Gomez等人（2007）的研究也证明，内分泌干扰物可被吸附到颗粒物的表面，从而被膜所截留.王晓东等人（2006）的研究发现，臭氧氧化可部分去除饮用水中的壬基酚（NP）等酚类物质.此外，对于杀虫剂如阿特拉津（Hua et al.,2006）、灭多威（李绍峰等，2007）等内分泌干扰物，臭氧也有较好地去除效果.由于微滤和臭氧氧化对于内分泌干扰物都有不同程度的去除，使得水样在加氯前，孕激素酵母酶活性的抑制率显著降低.

再生水中含有较多的脂肪族化合物以及有机氯和卤素（Tanita and Kimberly,2005），氮、氯取代的芳香性和脂肪族物质是氯消毒副产物重要的前体物质（郭瑾和彭永臻，2007）.再生水厂的前处理一般可将大分子的消毒副产物前体物质去除.臭氧的强氧化性能够破坏消毒副产物前体物的双键结构，从而抑制卤素与双键的加成或取代反应，但是，臭氧在氧化大分子有机物的同时，也产生了含有醛和酮结构的小分子有机物，这类有机物也是较强的消毒副产物前体物质（陈超等，2005）.这可能导致了水厂出水在加氯后有氯消毒副产物生成，而有文献证明该类物质具有内分泌干扰效应（胡建英和杨敏，2001），从而导致再生水厂E出水的孕激素抑制活性显著增强.

再生水厂F的主要处理工艺为：曝气沉砂池+MBR反应器+氯气消毒.曝气沉砂池主要去除污水中的无机颗粒、油脂类物质以及少量的有机污染物（王栋等，2006），对孕激素抑制剂去除效率贡献不大.膜生物反应器（MBR）是结合膜分离和生物处理方法的联合技术.再生水厂F水样经MBR反应器后，对孕激素酶活性的抑制率降低了32.1%，远低于臭氧氧化（再生水厂E）.有研究显示，在MBR反应器缺氧池中，壬基酚聚氧乙烯醚大量降解为壬基酚，其转化率大于壬基酚在污泥中吸收和降解的速率（Hu et al.,2007），且壬基酚是典型的孕激素抑制剂，这可能是MBR反应器对孕激素抑制活性物质处理效果不佳的一个原因.

与再生水厂E的检测结果相同，再生水厂F出水在加氯后，孕激素抑制活性也有所增强.由此可以推断，后加氯工艺是导致水厂出水具有较高孕激素抑制活性的主要原因.

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EstrogenandProgesteroneInterferenceEffectofSewageand Reclaimed Water Treatment Process in Tianjin

ZHUANG Li-li1，2，MA Mei2，*，RAO Kai-feng2，CHEN Yu-cheng1

1.College of Resources and Environment,Southwest University,Chongqing 400715
2.State Key Laboratory of Environmental Aquatic Chemistry,Research Center for Eco-Environmental Sciences,Chinese Academy of Science,Beijing 100085

Recombinant gene yeast was used to detect estrogen and progesterone interference effect of thirteen water samples from four sewage treatment plants and two reclaimed water plants in Tianjin.Estrogen inductive activity was detected in the influents of three sewage treatment plants,with the highest 17β-estradiol equivalents（EEQ）of 10.7ng·L-1.And all the water samples had no progesterone inductive activity,but progesterone inhibiting activity.And the water samples which were detected estrogen inductive activity had higher progesterone inhibiting activity correspondingly.All the sewage treatment plants could not wipe off the progesterone inhibitors totally,with the removal rates between 44%and 78%.The removal rate of progesterone inhibitors by microfiltration and ozonation was superior to that by MBR.The inhibition ratios of effluents of reclaimed water plants increased after chlorination.

recombinant gene yeast；waste water treatment plant；reclaimed water plant；estrogen；progesterone

8 January 2010accepted10 February 2010

1673-5897（2010）2-222-07

X882.5，X131.3

A

2010-01-08录用日期：2010-02-10

国家高技术研究发展计划（863）探索导向项目（No.2007AA06Z414）；水体污染控制与治理科技重大专项（No.2008ZX07314-003）；天津市科技创新专项资金项目（No.06FZZDSH00900）

庄丽丽（1984—），女，硕士研究生，E-mail:lili3425@163.com；*通讯作者（Corresponding author），E-mail:mamei@rcees.ac.cn

马梅（1967—），女，博士，中国科学院生态环境研究中心环境水质学国家重点实验室研究员，博士生导师，主要研究方向为水生态毒理学.