奥曲肽联合长春新碱对胃癌细胞的抑制作用

苏海燕，刘文天，王邦茂，张文治，苏 心

（1.天津医科大学总医院消化科，天津 300052；2.天津市环湖医院）

生长抑素类似物（somatostatin analogue，SSTA）的抗肿瘤活性近年来倍受关注，许多研究探讨了其抗增殖和诱导凋亡的作用机制[1]。本文将着重研究奥曲肽（octreotide,OCT）联合细胞毒化疗药物长春新碱（VCR）的抗肿瘤效果及其作用机制，探讨OCT是否能增强VCR的抗肿瘤活性，具有化疗药物增敏剂的作用。

1 材料与方法

1.1 试剂 人胃癌细胞系SGC-7901，由第四军医大学西京医院樊代明教授馈赠。胎牛血清（标准级），购自美国Hyclone公司。鼠抗人p53单克隆抗体，购自北京中山生物技术有限公司。生长抑素类似物--奥曲肽购自瑞士诺华公司。

1.2 方法

1.2.1 肿瘤细胞的培养 胃癌细胞SGC-7901培养于含10%热灭活胎牛血清的RPMI1640(含青霉素100 U/ml，链霉素 100 μg/ml)中 37 ℃，5%CO2饱和湿度下培养，0.25%胰酶＋0.02%EDTA 消化，3～4 d传代一次。

1.2.2 MTT实验 取对数生长期的人胃癌细胞株SGC-7901，调整细胞浓度为 1×104/ml，接种于 96 孔培养板中，每孔100μl，同时进行以下实验。

1.2.2.1 OCT对胃癌细胞的抑制：实验分组：（1）空白组，不含细胞和药物。（2）对照组，含细胞不加药物。（3）OCT组，每孔中加入OCT后其终浓度分别为1×10-3g/L、1×10-4g/L、1×10-5g/L、1×10-6g/L、1×10-7g/L、1×10-8g/L、1×10-9g/L。以上各组每个浓度均设 8 个平行复孔，培养 24 h 后加入 MTT（5mg/ml），培养 4 h，弃上清液，每孔加入DMSO，震荡至MTT完全溶解，酶联检测仪600 nm处测吸光度，求抑制率。抑制率=（对照组OD-实验组OD）/对照组OD×100%。

1.2.2.2 VCR对胃癌细胞的抑制：实验分组：（1）空白组。（2）对照组。（3）VCR组，每孔中加入VCR后其终浓度分别为 1×10-4g/L、1×10-3g/L、2.5×10-3g/L、5×10-3g/L、7.5×10-3g/L、1×10-2g/L。方法同 1.2.2.1，求抑制率。

1.2.2.3 OCT联合VCR对胃癌细胞的抑制：选择浓度为1×10-5g/L的OCT，联合5×10-3g/L的VCR，求抑制率。方法同1.2.2.1。

1.2.3 免疫组化法测定p53蛋白在胃癌细胞的表达

将实验分为对照组、OCT 组（1×10-5g/L）、VCR组（5×10-3g/L）和 OCT+VCR 组，37 ℃，5%CO2孵育箱中培育24 h后弃去板中培养液，PBS冲洗，固定，室温孵育，血清封闭，加鼠抗人p53单克隆抗体4℃过夜，次日加入山羊抗小鼠IgG，滴加SABC，加入DAB-H2O2显色，显微镜观察。在Olympus倒置光学显微镜下p53阳性细胞呈棕黄或棕黑色，与背景同色为阴性。而后200倍显微镜下计数5个视野，计算阳性细胞百分数。

1.3 统计学分析 采用t检验、方差分析、χ2检验进行处理。P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 对胃癌细胞增殖的影响

2.1.1 OCT对胃癌细胞的抑制 随着OCT浓度由1×10-9g/L逐渐增加至1×10-5g/L时，其抑制率由7.9%逐渐增加至20.9%；但是继续增加OCT浓度至1×10-3g/L，其抑制率反而下降至14.3%。即当浓度为1×10-5g/L时，OCT抑制率最大，其抑制率明显高于对照组（P<0.05）。

2.1.2 VCR对胃癌细胞的抑制 随着VCR浓度的增加，其抑制率也逐渐增加，由5.2%增加至53.6%，呈递增趋势。当VCR浓度为5μg/ml时，其抑制率为16.2%，为小于IC50的适宜浓度。

2.1.3 OCT联合VCR对胃癌细胞的抑制 当OCT联合VCR时，抑制率为42.3%，明显高于VCR组，有统计学差异（P<0.05），见图1。

2.2 OCT、VCR及OCT联合VCR对胃癌细胞中p53蛋白表达的影响 OCT、VCR和OCT+VCR均可以上调p53的表达，与对照组相比有统计学差异（P<0.05），其中OCT+VCR联合应用上调作用最明显，见图2。

3 讨论

SSTA已用于许多临床疾病的治疗，如肝硬化食管静脉曲张出血以及急性胰腺炎等，并取得良好疗效。近年来，SSTA对肿瘤生长的抑制作用受到越来越多的关注，而且其副作用远比临床上常用的常规化疗药物低[2]。许多学者认为SSTA有可能成为恶性肿瘤生物治疗新的、候选手段[3-5]。OCT为临床中常用的人工合成的SSTA。

SSTA的抗肿瘤机制分为直接作用和间接作用。SSTA与存在于肿瘤细胞表面的生长抑素受体（somatostatin receptor,SSTR）结合发挥直接作用。SSTR亚型的研究显示，SSTR3蛋白分布于正常胃黏膜的细胞膜、细胞质或黏膜下间质组织，在胃癌细胞膜上也有SSTR3蛋白表达。还有研究显示胃癌肿瘤组织中存在5种SSTR亚型的表达，并以SSTR2的表达最为显著[6-7]。多种肿瘤表达SSTR，SSTA与不同亚型SSTR具有高亲和力，这是应用SSTA治疗肿瘤的分子基础[8]。SGC7901是人低分化胃腺癌细胞，已知其细胞膜表达SSTR2，3[9-10]。SSTA还可以抑制某些对肿瘤细胞生长有促进作用的激素和生长因子的分泌与释放，如胰岛素样生长因子、表皮生长因子、胃泌素胆囊收缩素及胰岛素等，抑制肿瘤血管形成以及诱导肿瘤细胞发生凋亡，从而发挥间接抗肿瘤作用。

本研究结果显示，OCT作用于胃癌细胞系SGC-7901，随着其浓度的增加抑制率也增加，当其浓度达到1×10-5g/L时，抑制率达到最大，为20.9%。但是如果浓度继续增加，其抑制率反而下降，提示OCT对SGC-7901的抑制具有饱和性，这也间接提示了SGC-7901表面存在与OCT结合的SSTR。

实验中，我们选取了不需体内转化的胃癌常用的植物抗癌药VCR进行研究。为了便于观察，我们选取了较低浓度的VCR（5×10-3g/L），在该浓度时其抑制率为16.2%。联合OCT后其抑制率上升至42.3%。该结果提示二者联合应用，可使VCR的抑制胃癌细胞生长的作用明显增强。由此看出，OCT可能具有了VCR增敏剂的作用。

p53蛋白是细胞周期的“分子警察”，也是在DNA损伤后诱导凋亡的因子。一方面，p53蛋白通过上调p 21蛋白来介导细胞周期停滞，细胞周期停滞可以为DNA修复赢得时间；另一方面，如果细胞内损伤已无法修复，则p53蛋白促进细胞凋亡。p53蛋白在细胞中的积累和活动引起了细胞凋亡，可以消除损伤细胞向癌细胞发展[11]。许多化疗和放疗均依赖p53诱导的凋亡途径。本实验结果显示，OCT可以上调p53的表达，通过诱导细胞凋亡，达到抑制肿瘤细胞生长的目的。因此，我们推测OCT调控凋亡基因，可能是其抑癌的机制之一。已有研究表明化疗药物在体内同样诱导细胞凋亡，本实验也证实了这一点。OCT联合VCR后，增强了VCR上调p53的作用，使其阳性细胞指数由24.8%上升至30.8%。因此OCT在细胞凋亡水平可以增强VCR对肿瘤细胞的抑制作用。

OCT联合应用较低浓度的VCR，可以达到与高浓度VCR相同的抑制胃癌细胞的效果，同时可以增强其诱导细胞凋亡的作用，这就为一种治疗胃癌新方法的引入提供了细胞水平的实验基础。

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