缺血后适应对大鼠局灶性脑缺血再灌注后细胞凋亡的影响

武慧丽 ，李 新 ，王纪佐

（1.天津医科大学第二医院神经科，天津 300211；2.武警医学院附属医院）

随着介入治疗成为心肌梗死、动脉栓塞及缺血性脑血管病得力的治疗手段，缺血再灌注损伤日益受到关注。心肌梗死后，缺血再灌注损伤发生于再灌注早期，主要病理变化是血管内皮功能失调、心肌收缩功能下降、心肌细胞坏死和凋亡。12 h内梗死区，尤其是收缩带有凋亡心肌细胞存在，提示缺血再灌注损伤的主要病理表现是细胞凋亡。2003年Zhao等[1]首先用犬心肌缺血再灌注模型，于再灌注开始时连续3次，每次30 s再灌注，30 s闭塞，发现其可减轻再灌注损伤，限制梗死范围，减轻缺血心肌的组织水肿和中性粒细胞积聚，改善内皮细胞功能。此法对缺血/再灌注心肌的保护作用被命名为“缺血后适应（ischemic postconditioning，IP）”。已有大量研究证实IP对缺血再灌注的心肌有保护作用，最近的研究发现IP可能对缺血脑组织也有保护作用，其机制可能通过提高脑缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）后的抗氧化能力，保护线粒体的结构与功能，从而减轻I/R对脑组织的损伤[2-3]。IP能否影响I/R损伤脑组织中细胞凋亡，尚不清楚。本实验采用大脑中动脉线拴法复制大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤动物模型，研究IP对大鼠局灶性脑I/R损伤后细胞凋亡的影响及可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 P38单克隆抗体、Caspase-3单克隆抗体购自Santa CruzCA公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔/兔抗小鼠IgG购自鼎国生物制品公司；Western blotting检测试剂盒，BCA试验盒，TUNEL法细胞凋亡检测试验盒，化学发光试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 实验动物及分组 雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，体质量250~300 g，由武警医学院实验动物中心提供。动物随机分为假手术组(sham)、脑缺血再灌注组（I/R）和缺血后适应组（IP），每组10只动物。

1.2.2 动物模型的制备 Longa法[4]制作大鼠局灶性脑I/R模型：大鼠称重，腹腔注射体积分数10%水合氯醛300mg/kg麻醉，做颈部正中切口，暴露右颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，在颈外动脉距其始端约2mm处做一小切口，将3-0尼龙线一端烤成小球形经切口处插入颈外动脉，再经颈内动脉至大脑中动脉始端，栓塞大脑中动脉，造成局灶性脑缺血，大鼠脑缺血90min后，拔出尼龙线，恢复脑组织供血，24 h后取材。Sham组大鼠在尼龙线小球端插入至大脑中动脉始端后，立即拔出。IP组在缺血90min后再灌注开始时将尼龙线拔出5mm，恢复脑血流20 s；再将尼龙线放进5mm，阻塞脑血流20 s，按上述时间循环3次后进行长时间血流再灌注。

1.2.3 神经病学评分 手术后功能缺损按Longa5分制标准进行评分：0分，无明显神经病学症状；1分，不能完全伸展左前肢；2分，向左侧旋转；3分，行走时向左侧倾倒；4分，不能自行行走，有意识障碍。累积1分以上即为成功模型。动物苏醒后，观察缺血动物的神经功能缺失症状。

1.2.4 取材 脑缺血再灌注24 h后，用10%水合氯醛(300mg/kg)对大鼠进行麻醉。每组5只大鼠开胸经左心室至主动脉插管，并以止血钳固定，剪开右心耳，先快速灌注生理盐水100ml左右，然后灌注4℃的4%多聚甲醛磷酸缓冲液400~600ml。断头取脑，脑组织置于4%多聚甲醛磷酸缓冲液固定1~2 h，再放入30%蔗糖溶液浸泡沉底。恒冷箱切片机冠状连续切片，片厚10μm，用于凋亡细胞的检测。其余5只大鼠经10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，迅速断头取脑，于冰上分离缺血侧顶叶皮层脑组织，用冰生理盐水冲洗后，迅速置于液氮罐中低温保存用于免疫印迹法（Western blotting）检测 P38、Caspase-3 的蛋白表达。

1.2.5 TUNEL法检测细胞凋亡 脑组织按1.2.4处理，制成10μm的冰冻切片，按试剂盒说明进行操作。光镜下，脑组织切片中细胞呈棕色者为阳性细胞。高倍镜下随机选取每张切片梗死周边组织5个视野，分别计数TUNEL阳性细胞数和总细胞数，计算凋亡细胞百分率，取平均值。凋亡细胞百分率=TUNEL阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.2.6 Western blotting 采用常规Western blotting检测方法进行操作。等量蛋白样品经10%SDS-聚丙烯凝胶电泳分离后,以湿转法电转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，用新鲜配制的含3%脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）封闭，然后加入P38兔单克隆抗体 (1∶500)，Caspase-3 鼠单克隆抗体(1∶1 000)，4 ℃反应过夜。将膜取出，用PBS洗涤3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(山羊抗兔/兔抗小鼠IgG)孵育，最后用化学发光法或X-线片记录结果。

1.3 统计学处理 数据资料采用均数±标准差表示，统计学分析采用SPSS 13.0统计软件包，多组间均数比较采用单因素方差分析，方差分析有显著差异时，进一步用q检验作两两比较，P<0.05认为差异有显著性。

2 结果

2.1 缺血后适应对神经病学评分的影响 I/R组大鼠术后均出现明显的神经功能缺损症状，大多表现为不同程度的左侧前肢屈曲、向左侧旋转，行走时向左侧倾倒。Sham组大鼠有3只出现左前肢轻度屈曲症状。IP组大鼠神经功能缺损症状比I/R组明显减轻。各组评分相比较，差异有显著性（P<0.01），见表1。

2.2 缺血后适应对神经细胞凋亡的影响 Sham组偶见凋亡细胞，I/R组缺血区可见较多凋亡细胞，细胞核着色深，主要见于梗死灶周围，与Sham组比较有显著差异（P<0.01）。IP组凋亡细胞百分率明显减少，胞核颜色明显变浅，与I/R组比较差异显著（P<0.01），见表 l。

表1 缺血后适应对神经病学评分和细胞凋亡的影响

2.3 缺血后适应对P38和Caspase-3蛋白表达的影响 P38和Caspase-3蛋白表达在Sham组呈较低水平。I/R组大鼠，局灶性脑缺血再灌注后，两种蛋白表达均明显升高。在IP组，两种蛋白表达较I/R组均明显降低，但仍高于Sham组。表明缺血后适应明显减少缺血后再灌注脑组织中P38和Caspase-3的表达，见图1。

3 讨论

缺血后适应是机体对缺血性损伤的一种内源性保护机制，它可以通过抑制活性氧的产生[5]、抑制炎症反应[6]、减少凋亡的发生[5]，减轻缺血心肌细胞的损伤。有文献报道[2-3，7]在脑的缺血后适应研究中，缺血后适应提高脑组织对缺血缺氧的耐受性,减少神经元凋亡，抑制p53、Bax表达，增加线粒体Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase、SOD 活性，对脑缺血再灌注产生保护作用。近年来研究表明，丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK) 信号转导通路参与脑缺血－再灌注损伤后的神经细胞凋亡[8]。P38是MAPK信号转导通路的重要成员之一，是将胞外信息传递到胞核的重要介导者。Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中Caspase-3为关键的执行分子。研究发现，Caspase-3参与了脑缺血后神经元损伤的病理过程[9]。缺血后适应减少大鼠脑缺血再灌注后细胞凋亡发生的作用机制是否与抑制P38和Caspase-3蛋白表达有关尚未见报道。

本实验结果显示：大鼠脑缺血再灌注后凋亡细胞数量、P38和Caspase-3蛋白表达水平均显著升高，而缺血后适应组凋亡细胞数量、P38和Caspase-3蛋白表达水平均显著低于缺血再灌注组。P38及Caspase-3在缺血再灌注损伤后细胞凋亡中起着重要的作用。本研究结果提示缺血后适应抑制缺血后脑组织中P38蛋白表达，从而可能减轻MAPK信号转导通路介导的脑缺血再灌注损伤后的神经细胞凋亡；另一方面缺血后适应可减少Caspase-3蛋白表达，减少细胞凋亡的发生，减轻脑缺血再灌注损伤的程度。

缺血后适应的干预过程简单，临床可操作性强，无疑对介入动脉取栓，缩小梗死面积，减少对重要脏器的损害，改善生活质量，提高患者的生存率具有重要意义，因此具有良好的临床应用前景。脑血管的复杂结构及脑组织对缺血的耐受特性，使脑缺血后适应的实施时间窗及实施方法尚有待于深入研究，然而对于脑梗死早期血管成形术或介入治疗血管再通过程中，后适应可能有助于减少再灌注损伤，从而提高再灌注治疗的疗效。

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