微波辅助提取绞股蓝黄酮工艺研究

2010-10-19王青豪张熊禄

食品科学 2010年22期

关键词：索氏绞股蓝芦丁

王青豪，方芳，张熊禄

(赣南师范学院化学与生命科学学院，江西赣州 341000)

微波辅助提取绞股蓝黄酮工艺研究

王青豪，方芳，张熊禄

(赣南师范学院化学与生命科学学院，江西赣州 341000)

采用单因素试验和正交试验，进行微波辅助提取绞股蓝黄酮的工艺研究，得到微波辅助提取绞股蓝黄酮的最佳工艺条件：溶剂为30%乙醇溶液、料液比1:32(g/mL)、微波处理时间15min；在此工艺条件下绞股蓝黄酮提取率为4.18%。与索氏提取法相比，微波辅助提取既能缩短提取时间又能提高绞股蓝黄酮的提取率。

绞股蓝；黄酮；微波辅助提取；工艺

Abstract：Microwave-assisted extraction of flavonoids fromGynstemma pentaphyllumwas explored by single factor and orthogonal experiments. The optimal extraction processing parameters were 30% ethanol as solvent, material-liquid ratio of 1:32 (g/mL), and microwave treatment time of 15 min. Under the optimal extraction conditions, the extraction rate of flavonoids fromGynstemma pentaphyllumwas 4.18%. Compared with traditional extraction method, microwave-assisted extraction can shorten extraction time and improve the extraction rate of flavonoids fromGynstemma pentaphyllum.

Key words：Gynstemma pentaphyllum；flavonoids；microwave-assisted extraction；processing technology

绞股蓝[Gynostemma pentaphyllum(Thunb.) Makino]是葫芦科绞股蓝属的多年生草质藤本植物，素有“南方人参”之美称。绞股蓝性寒、味甘、微苦，归肺、脾、心、肾经，有补气养阴、清肺化痰、养心安神之功效[1]。在绞股蓝的活性成分中，黄酮类化合物是除皂苷、多糖外的另一种主要活性成分，尤其叶中含量最多，但对绞股蓝黄酮类化合物的研究较少[2-3]。

国内外已经发现的黄酮类化合物有数千种，其中大多数具有显著的生理活性，对一些常见病、多发病有重要的生理作用，如有抗氧化和清除氧自由基作用；抗癌、防癌作用；改善心脑血管循环、扩张冠状动脉血管、松弛支气管、利尿以及明显的抗血小板活化因子等作用[4-5]。

传统的黄酮提取方法有浸提法、索氏法和回流法等[6-7]。微波提取技术能强化浸提过程，具有加热快且均匀、节能、产率高等优点，该技术既能降低操作费用，又合乎环境保护的要求，是一种有良好发展前景的新工艺，已被广泛应用于植物有效活性成分提取。采用微波技术能提高天然产物的萃取效率，与常规方法相比可大大缩短提取所需的时间[8-10]。本研究采用微波辐射从绞股蓝茶叶中提取黄酮类化合物，期望为绞股蓝黄酮的进一步精制及其应用研究提供依据[11-14]。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与试剂

绞股蓝茶叶(产自粤北丹霞山)。芦丁、无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝(均为分析纯)、氢氧化钠。

722光栅分光光度计上海第三仪器厂；三乐牌WP650D家用微波炉(经南京蓝通科工贸有限公司改装)；R-201旋转蒸发仪郑州长城科工贸有限公司。

1.2 方法

1.2.1 标准曲线的绘制[15-16]

准确称取0.1326g芦丁标准样品，用30%乙醇溶解并定容于500mL棕色容量瓶中，待用。分别移取上述芦丁标准液0.0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0mL于6只50mL容量瓶中，各加入1.0mL 50g/L NaNO2溶液混匀，放置6min后加入1.0mL 100g/L Al(NO3)3溶液混匀，放置6min，再加入10.0mL 40g/L NaOH溶液，最后用30%乙醇定容至刻度，再放置15min后于500nm波长处测其吸光度A，以芦丁质量浓度Y(g/L)为纵坐标、吸光度A为横坐标绘制标准曲线。

芦丁质量浓度Y(g/L)与吸光度A的线性回归方程为：Y=0.1078A+0.00314(r=0.9995)，芦丁质量浓度Y在0.0053～0.0424g/L范围内与吸光度A之间有较好的线性关系。

1.2.2 绞股蓝黄酮提取工艺流程

绞股蓝茶叶→称量→溶剂浸泡→微波处理→过滤除杂→回收乙醇→浓缩液用水定容→分光光度法检测提取液中的黄酮质量分数→计算黄酮提取率

1.2.3 索氏提取法

采用索氏提取器提取绞股蓝茶叶中的总黄酮，提取液按制定标准曲线的方法显色后测其吸光度A，代入回归方程计算其黄酮质量分数及总黄酮质量，再除以原料绞股蓝茶叶的质量即为绞股蓝茶叶中总黄酮的百分含量(索氏提取法的黄酮提取率)，据此与微波辅助法进行比较。

1.2.4 微波辅助提取单因素试验

在微波辐射功率固定、绞股蓝茶叶粒度固定的条件下，影响黄酮提取率的因素有提取次数、温度、溶剂体积分数、料液比、微波辐射时间等。在一次提取绞股蓝黄酮时，物系温度随微波辐射时间(微波功效)而升高。因此本实验仅考查乙醇体积分数、料液比和微波时间对绞股蓝黄酮提取率的影响。

1.2.5 微波辅助提取工艺条件的正交试验设计

根据单因素试验的结果与分析选取乙醇体积分数、料液比、微波时间3个因素，各设定3个水平进行正交试验。

选用250mL圆底烧瓶，每次试验固定溶剂体积160mL，根据不同的料液比而改变原料质量。为了控制回流高度，微波炉采用20%功率档(每30s只辐射6s，间隔24s。微波功效为130W/min)。提取液根据各组实验情况回收乙醇，浓缩液用蒸馏水定容至500mL，取2.0mL按制作芦丁标准曲线的方法显色，最后用30%的乙醇定容于50mL后检测其吸光度，按1.2.6节公式计算黄酮质量分数和黄酮提取率。

1.2.6 黄酮质量分数和黄酮提取率的计算公式

提取液中黄酮质量浓度C/(g/L)=(0.1078A+0.00314)×25

2 结果与分析

2.1 索氏法提取绞股蓝黄酮

准确称取干燥有固定粒度的5.0g绞股蓝茶叶，用脱脂滤纸包好放入索氏抽提器中，用95%乙醇160mL抽提14h，至虹吸管中无颜色为止。提取液回收乙醇后用蒸馏水定容于500mL容量瓶中，取2.0mL按制作芦丁标准曲线的方法显色，最后用30%乙醇定容于50mL容量瓶中，测得吸光度为0.093，按1.2.6节的方法计算黄酮提取率。提取液中黄酮质量浓度C=0.329g/L，黄酮提取率为3.29%，即以95%乙醇为溶剂，采用传统的索氏提取法，绞股蓝黄酮的提取率是3.29%。

2.2 微波辅助提取单因素试验

2.2.1 乙醇体积分数对绞股蓝黄酮提取率的影响

精确称取干燥有固定粒度的5.0g绞股蓝茶叶放入250mL圆底烧瓶内，加入溶剂浸泡至绞股蓝茶叶充分湿润后再进行微波辅助提取绞股蓝黄酮。为了控制回流高度，微波炉采用20%功率档(每30s只辐射6s，间隔24s。微波功效为130W/min)。在固定条件下：料液比1:24(g/mL)、微波时间30min，分别用95%、60%、30%和0%(纯水)乙醇进行微波辅助提取黄酮，过滤除渣，提取液回收乙醇后用蒸馏水定容于500mL容量瓶中，取2.0mL按制作芦丁标准曲线的方法显色，最后用30%乙醇定容于50mL容量瓶中，测定吸光度，按1.2.6节方法计算黄酮提取率，结果见图1。

图1 乙醇体积分数对黄酮提取率的影响Fig.1 Effect of alcohol concentration on extraction rate of flavonoids fromGynstemma pentaphyllum

由图1可以看出，随乙醇体积分数的增大提取率先是增加而后则缓慢降低，这是因为黄酮类化合物为多羟基酚类其极性比乙醇强而比水弱，较易溶于中等体积分数的乙醇溶液。另外，用纯水时得到的提取液泡沫多，难过滤，其原因是提取液含有较多的多糖和氨基酸。而用95%乙醇时，皂苷、色素及其他脂溶性物质溶出也较多，而且溶剂的挥发性大，生产成本也提高。因此，初步确定30%～60%的乙醇为合适的溶剂。

2.2.2 料液比对绞股蓝黄酮提取率的影响

图2 料液比对黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of material-liquid ratio on extraction rate of flavonoids fromGynstemma pentaphyllum

在固定条件下：30%乙醇、微波时间30min，分别以料液比1:32、1:24、1:16、1:8(g/mL)，按2.2.1节方法进行微波辅助提取并检测黄酮，并按1.2.6节方法计算黄酮提取率，结果见图2。

由图2可以看出，随液体量的增大提取率也增大，提取率先是增加较多而后趋近于最大值，这是因为液体量太低时溶剂不能完全溶胀原料以及完全溶解出黄酮，但太高时又增加生产成本以及增加后续处理的难度。因此，初步确定1:32～1:16(g/mL)为合适的料液比。

2.2.3 微波时间对绞股蓝黄酮提取率的影响

按2.2.1节方法，在固定条件下：30%乙醇、料液比1:24(g/mL)，分别用60、30、15、5min微波辅助提取并检测黄酮，并按1.2.6节方法计算黄酮提取率，结果见图3。

图3 微波时间对黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of microwave treatment time on extraction rate of flavonoids fromGynstemma pentaphyllum

由图3可以看出，随微波时间的增加提取率先是增加较多，达到最大值后随着微波时间的增加提取率反而有所下降。这是因为微波的作用机制是微波直接作用于分子，使分子的热运动加剧，从而引起温度升高，可以快速破坏细胞壁，使细胞内的有效成分更快的分离浸提出来。当微波时间达到15min以上时细胞破裂完全，细胞内的有效成分大部分可浸提出来。但试验时发现，微波时间为60min时绞股蓝茶叶有焦化现象，黄酮提取率反而降低，这可能是长时间辐射后绞股蓝茶叶中的有效成分结构被破坏的结果。因此，初步确定10～20min为合适的微波处理时间。

2.3 微波辅助提取工艺正交试验

表1 L9(33)正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

由表2中的平均值k和极差R分析表明：正交试验考察的3个因素对微波辅助提取绞股蓝黄酮影响大小顺序为料液比＞乙醇体积分数＞微波时间。得出的最佳提取工艺组合是乙醇体积分数30%、料液比1:32(g/mL)、微波处理时间15min。为考察正交试验得出的最佳工艺条件的稳定性，以最佳工艺条件做重复实验，在此条件下绞股蓝黄酮的提取率为4.18%，说明正交试验设计合理有效。

表2 L9(33)正交试验设计及结果Table 2 Results of orthogonal experiments

料液比1:32(g/mL)与1:24(g/mL)的平均提取率k相差很小，因此，若在实际工业生产中，参照最佳工艺条件，为节省溶剂以及减轻后续处理，也可选择30%乙醇、料液比1:24(g/mL)、100%功率档(微波功效为650W/min)微波辅助提取3min，同样也可以达到较好的提取效果，此条件下的黄酮提取率是4.13%。

以绞股蓝茶叶为原料，索氏法提取14h，其黄酮提取率是3.29%；而用微波辅助法提取15min，黄酮提取率为4.18%。比较可知：微波辅助提取既能缩短提取时间又能提高绞股蓝黄酮的提取率。

3 结论

微波辅助提取法经正交试验优化后的最佳工艺条件：乙醇体积分数30%、料液比1:32(g/mL)、微波处理时间15min。此工艺条件下绞股蓝黄酮提取率为4.18%。微波辅助提取法与索氏提取法相比，微波辅助提取既能缩短提取时间又能提高绞股蓝黄酮的提取率。

[1] 陈武, 邹盛勤, 吴晓春, 等. 绞股蓝无糖口含片的制备工艺研究[J].食品科学, 2008, 29(3):245-248.

[2] BAI Mingsheng, GAO Jinmin, FAN Chen, et al. Bioactive dammarane-type triterpenoids derived from the acid hydrolysate ofGynostemma pentaphyllumsaponins[J]. Food Chemistry, 2010, 119(11):306-310.

[3] LU You, YANG Xingbin, ZHAO Yan, et al. Separation and quantification of component monosaccharides of the tea polysaccharides fromGynostemma pentaphyllumby HPLC with indirect UV detection[J].Food Chemistry, 2009, 112:742-746.

[4] 周建华, 张兴亚. 绞股蓝开发研究新进展及应用[J]. 食品科技, 2010,35(2):74-76.

[5] 徐宁, 张峰, 肖远胜, 等. 中药黄酮类化合物[J]. 大学化学, 2010, 25(4):105-108.

[6] 陈业高. 植物化学成分[M]. 北京:化学工业出版社, 2004.

[7] 刘成梅, 游海. 天然产物有效成分的分离与应用[M]. 北京:化学工业出版社, 2003.

[8] 金钦汉. 微波化学[M]. 北京:科学出版社, 1999.

[9] 池爱平, 陈锦屏. 微波辅助提取绞股蓝多糖的工艺研究[J]. 食品科学, 2007, 28(7):181-184.

[10] 朱远平. 金柚皮总黄酮的微波辅助提取工艺研究[J]. 食品科学, 2009,30(12):73-77.

[11] 柳嘉, POPOVICH D G, 景浩. 山楂黄酮提取物的抗氧化活性和对癌细胞生长抑制作用[J]. 食品科学, 2010, 31(3):220-223.

[12] 叶春, 张婧. 大孔树脂对野菊花总黄酮吸附分离特性的影响[J]. 食品科学, 2010, 31(12):127-131.

[13] 陈蕉, 黎云祥, 陈光登, 等. 大孔吸附树脂分离纯化峨嵋岩白菜叶总黄酮[J]. 食品科学, 2010, 31(6):74-79.

[14] 刘志祥, 曾超珍, 张玥. AB-8大孔树脂分离纯化枸骨叶总黄酮的工艺研究[J]. 食品科学, 2010, 31(12):76-79.

[15] 卢锦花, 胡小玲, 岳红, 等. 大孔吸附树脂对银杏叶黄酮类化合物吸附及解吸的研究[J]. 化学研究与应用, 2002, 14(2):164-166; 148.