非转座子载体介导的稳定转化家蚕BmN细胞表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子

陈慧梅，曹广力，薛仁宇，贡成良

苏州大学基础医学与生物科学学院，苏州 215123

非转座子载体介导的稳定转化家蚕BmN细胞表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子

陈慧梅，曹广力，薛仁宇，贡成良

苏州大学基础医学与生物科学学院，苏州 215123

为了建立非转座子载体介导的持续表达外源基因的转化家蚕BmN细胞系，将家蚕核型多角体病毒极早期基因(ie-1)启动子控制的人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)基因的表达盒克隆至 pIZT/V5-His，获得重组载体pIZT-IE-hGM-CSF，该载体转染家蚕BmN细胞后，通过博莱霉素(Zeocin)筛选获得了稳定转化细胞系IE-hGM-CSF。转基因细胞基因组经PCR鉴定，成功检测到ie-hGM-CSF，Western blotting分析结果显示转化细胞表达的重组hGM-CSF的大小为22 kDa，ELISA检测结果显示hGM-CSF在转化细胞系里的表达水平大约为2 814.7 pg/106个细胞。

转化，pIZT/V5-His，hGM-CSF，BmN细胞

Abstract:To develop the stable transformants of the silkworm(Bombyx mori)BmN cells that could continuously express the exogenous gene based on a non-transposon vector, an expression cassette containing human granucyto-macrophage colony-stimulating factor(hGM-CSF)gene driven byie-1 promoter fromB.morinucleopolyhedrovirus was inserted into pIZT-V5-His to form a recombinant vector pIZT-IE-hGM-CSF, followed by transfecting the constructant into BmN cells, the stable ie-hGM-CSF cell lines were obtained after being selected with Zeocin.PCR result using the genomic DNA of the transformed BmN cells as template illustrated a specific fragment ofie-hGM-CSF, and Western blotting analysis using an antibody against hGM-CSFdemonstrated a specific band with a molecular weight of 22 kDa in the transformed cells,meanwhile, the expression level of hGM-CSF determined by ELISA was about 2 814.7 pg in 106transformed BmN cells.

Keywords:transformation, pIZT/V5-His, hGM-CSF, BmN cells

目前主要通过大肠杆菌、酵母、昆虫细胞以及哺乳动物细胞 4种系统来表达外源蛋白[1]，这 4大表达系统在科学研究、新药研发等方面发挥了巨大的作用。大肠杆菌表达系统属于原核表达系统，具有良好的操作性、成本低等优点，但重组蛋白不能进行翻译后修饰加工，难以获得高活性的目的蛋白；酵母表达系统属于低级的真核表达系统，可以进行翻译后加工修饰，但发生错误修饰的机率较高；哺乳动物细胞表达系统经过加工修饰表达的外源蛋白与天然蛋白结构最为接近，但表达量不高，并且培养哺乳动物细胞成本高、操作复杂。昆虫细胞表达系统操作简单，易培养，成本相对较低，并且可以进行糖基化等修饰，可以生产得到高活性的外源蛋白。昆虫表达一般采用杆状病毒表达载体系统(BEVS)和稳定转化表达系统。BEVS是一种瞬时表达系统，昆虫细胞会因为病毒感染而死亡，外源基因不能实现连续、传代表达，另外尽管杆状病毒进入哺乳动物细胞不能产生有效感染，但目前仍未排除杆状病毒对宿主潜在的危害[2-3]，而通过昆虫转化细胞表达外源基因其表达水平较低，约为BEVS的1%[4]，但是通过转化昆虫细胞克服了BEVS的一些缺点，它是一种永久性的表达系统，形成的稳定转化系细胞可以持续、传代培养，并且昆虫细胞的安全性比BEVS的要高许多。目前已有一些获得稳定昆虫细胞系的报道[5-7]，但有关家蚕稳定转化细胞报道却不多见[7]。Jarvis等[4]利用苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californicamulticapsid nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)ie-1启动子控制 β-半乳糖苷酶基因表达元件的转基因载体转染Sf-9细胞，通过抗生素G418筛选，获得了稳定转化细胞系，并且经过多次传代后，外源基因仍能稳定表达；Cherbas等[5]通过相似的方法同样获得了稳定转化果蝇Drosophila melanogaster细胞系；赵越等[8]用携带neo、绿色荧光蛋白(gfp)及家蚕丝胶基因启动子(Pser-1)驱动人胰岛素样生长因子(hIGF-Ⅰ)表达的基于piggyBac转座子的转基因载体转染家蚕BmN细胞，经过G418的筛选，获得了可以稳定表达hIGF-Ⅰ的转化细胞系。

人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)是第1个被克隆和利用重组DNA技术生产的一种造血生长因子，能够刺激T细胞和巨噬细胞增殖、成熟和分化，具有极其重要的免疫调解功能，在造血调控和免疫调节中发挥着重要作用，因此具有十分重要的临床应用价值[9]。目前市场上销售的hGM-CSF多是通过大肠杆菌表达系统生产的重组蛋白，探讨 hGM-CSF的新表达方法对重组 hGM-CSF的生产有重要经济意义。

pIZT/V5-His是Invitrogen公司开发的一种能用于昆虫 Sf9细胞稳定表达外源基因的载体，该载体可随机多拷贝整合至昆虫细胞的基因组内，并且载体含有博莱霉素(Zeocin)抗性基因和绿色荧光蛋白(gfp)基因融合表达盒。利用该载体通过稳定转化Sf9细胞表达外源基因已有一些研究[10-12]，但用于家蚕BmN细胞的研究还不多见。目前BmN细胞广泛用于家蚕基因功能的鉴定、重组蛋白的表达、家蚕核型多角体病毒(Bombyx morinucleopolyhedrovius，BmNPV)的分子生物学研究等。它属于真核表达系统，具有细胞易培养、重组蛋白的后加工比较完善等优点。为了检测 pIZT/V5-His载体介导的转化家蚕细胞表达外源基因的能力，本研究将ie-1启动子控制的hGM-CSF表达盒克隆至pIZT/V5-His载体，获得了重组转基因载体 pIZT-IE-hGM-CSF，家蚕BmN细胞转染该载体后，通过Zeocin筛选获得了稳定表达hGM-CSF的稳定转化细胞系，为利用家蚕细胞表达外源基因提供了新的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

载体pIZT/V5-His购自Invitrogen公司。带有杆状病毒极早期启动子ie-1控制的 hGM-CSF表达盒的重组质粒 pSK-IE-hGM-CSF[13]、宿主菌E.coliTG1、家蚕卵巢来源的BmN细胞系均由苏州大学基础医学与生物科学学院生物化学与分子生物学实验室保存。限制性内切酶、PCR相关试剂、T4 DNA连接酶等购自 Fermentas公司。X-gal、IPTG、20×PBS等购自上海生物工程技术服务有限公司。凝胶回收试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司。hGM-CSF ELISA kit购自 USCN Life Science &Technology Company。兔抗 hGM-CSF抗体、HRP标记的羊抗兔IgG购自北京博奥森公司。TC-100昆虫细胞培养基、胎牛血清(FBS)、Lipofectin、博莱霉素均购自Invitrogen公司。

1.2 引物

参照 GenBank中的 BmNPV-T3株基因组全序列(Accession No.L33180))的/ie-1基因启动子区域序列和hGM-CSF基因序列，设计引物 p1(5′-CGGGTACC GATTTGCAGTTCGGGAC-3′，下划线表示EcoRⅠ酶切位点)、p2(5′-CGGAATTCC ACTCCTGGACTGGCTCCC-3′，下划线表示KpnⅠ酶切位点)，以及 hGM-CSF-1(5′-TGGATATCATGT GGCTGCAGAGCCTGC-3′，下划线表示EcoR V酶切位点)、hGM-CSF-2(5′-ATCTCGAGAAGCTTAT CACTCCTGGACTGGCTCCC-3′，下划线表示XhoI、Hind Ⅲ酶切位点)，引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 转基因载体PIZT-IE-hGM-CSF的构建

以质粒pSK-IE-hGM-CSF为模板，以p1/p2为引物，通过PCR扩增ie-hGM-CSF片段(约1 kb)。扩增条件为：94℃预变性 5 min；95℃ 50 s，52℃50 s，72 ℃ 1 .5 min ，35个循环；72℃延伸10 min。PCR产物电泳、割胶回收后，用EcoRⅠ、KpnⅠ双酶切，与经同样酶切的 pIZT/V5-His载体连接，连接产物转化E.coliTG1的感受态细胞中，在含有博莱霉素的 LB培养基上培养，挑选单菌落，快抽质粒进行 PCR鉴定，鉴定正确的质粒命名为pIZT-IE-hGM-CSF。该载体的结构如图1所示。

图1 转基因载体PIZT-IE-hGM-CSF的结构示意图Fig.1 Schenmatic diagram of transgenic vector PIZT-IE-hGM-CSF.OpIE1: IE1 promoter of OpNPV;gfp: green fluorescent protein gene; Zeocin: Zeocin resistance gene;SV40pA: polyA signal of SV40; OpIE2: IE2 promoter of OpNPV; IEpro: IE1 promoter.

1.3.2 家蚕BmN细胞的转染与转化细胞的筛选

家蚕BmN细胞用含10%胎牛血清的TC-100在26℃培养，转染方法参考文献[14]中的方法进行。转染24 h后，在荧光显微镜下可观察到绿色荧光细胞，4 d后，更换细胞培养基，同时添加博莱霉素至终浓度30 mg/L，连续筛选1个月，期间观察绿色荧光细胞的比例。当绿色荧光细胞达80%以上时，收集细胞，抽提基因组进行鉴定。

1.3.3 hGM-CSF表达的检测

当绿色荧光细胞比例达70%以上时，弃细胞培养液，加1 mL 1× PBS反复吹打细胞，吸取细胞悬浮液，并用血球计数板计数，−20℃反复冻融3次后，10 000 r/min、4℃离心 10 min，取上清，稀释5倍，按照 ELISA试剂盒的使用说明测定 hGM-CSF的表达水平，重复 2次。剩余的上清加 2倍体积的无水乙醇，−20℃冷冻1 h，12 000 r/min，4℃离心10 min，弃上清，加30 µL的1× PBS溶解，与上样缓冲液混合后，100℃水浴5 min，离心后取上清进行 SDS-PAGE(浓缩胶为 5%，分离胶为15%)和Western blotting分析，Western blotting用兔抗 hGM-CSF为一抗，HRP标记的羊抗兔 IgG为二抗。

2 结果与分析

2.1 转基因载体pIZT-IE-hGM-CSF的鉴定

构建的质粒 pIZT-IE-hGM-CSF用EcoRⅠ、KpnⅠ进行双酶切，可检测到约1 kb的特异性条带；以 pIZT-IE-hGM-CSF为模板，p1/p2为引物，进行PCR鉴定，可扩增出约1 kb的特异性条带，另外对载体进行测序，各种结果均表明转基因载体pIZT-IE-hGM-CSF已构建成功。

2.2 pIZT-IE-hGM-CSF介导的转化细胞筛选与鉴定

pIZT-IE-hGM-CSF转染BmN细胞24 h后，在荧光显微镜下可以明显观察到部分细胞呈绿色荧光(图2A)，表明质粒DNA已进入细胞内，gfp基因已正确表达；转染4 d后开始用博莱霉素筛选，随着筛选时间的延长，荧光细胞比例逐渐增加。1个月后，荧光细胞比例可达 70%以上(图2B)，表明Zeocin抗性基因以及GFP基因已正确表达。并可在维持这一荧光比例的情况下稳定传代大约10次(图2C)，所获的转化细胞系命名为IE-hGM-CSF。为了鉴定外源DNA是否已整合至细胞基因组，以抗生素筛选2个月的荧光细胞基因组为模板，分别以p1/p2和 hGM-CSF-1/hGM-CSF-2为引物，可分别检测到约1 kb和430 bp的特异性产物，表明ie-1启动子控制的hGM-CSF基因已整合进细胞基因组(图3)。

图2 转染pIZT-IE-hGM-CSF后经zeocin筛选的转化BmN细胞Fig.2 Transformed cells screened from BmN cells transfected with pIZT-IE-hGM-CSF by using Zeocin.(A)24 hours after transfection.(B)One month after transfection.(C)Two months after transfection.

2.3 SDS-PAGE和Western blotting检测

为了分析hGM-CSF在转化细胞内的表达情况，收集博莱霉素筛选 2个月的转化细胞进行SDS-PAGE分析，未检测到Zeocin-GFP和hGM-CSF特异性条带，而Western blotting检测结果显示，在22 kDa处有明显的特异性条带出现(图4)，表明hGM-CSF已在转化细胞中正确表达。

2.4 ELISA检测转基因细胞中hGM-CSF的表达水平

根据hGM-CSF标准品的ELISA检测数据制作标准曲线(图5)，取转化细胞用ELISA试剂盒检测hGM-CSF的表达，由标准曲线计算结果：hGM-CSF在转基因 BmN细胞中的表达水平为 2 814.7 pg/106个细胞，而正常BmN细胞中基本未检测到。

图3 转化BmN细胞基因组的PCR鉴定Fig.3 PCR identification of transformated BmN cells.M:DNA marker; 1: detection of IE-hGM-CSF from the genome of transformated cells; 2: detection of hGM-CSF from the genome of transformated cells; 3,4: detection of hGM-CSF and IE-hGM-CSF from the genome of normal cells.

图4 转化细胞的SDS-PAGE及Western blotting分析Fig.4 SDS-PAGE and Western blotting analysis of transformed cells.M: protein marker; 1,2: SDS-PAGE detection of normal BmN cells and transformed cells respectively; 3,4:Western blotting detection of nomal BmN cells and transformated cells, respectively; the concentrations of the stacking gel and the separating gel were 5% and 15%,respectively; the primary antibody was rabbit anti-hGM-CSF and the secondary antibody was HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG.

图5 ELISA检测hGM-CSF标准曲线Fig.5 Calibration curve of hGM-CSF tested by ELISA.

3 讨论

利用转化昆虫细胞表达外源基因虽然没有BEVS的表达水平高[2]，但是转化昆虫细胞表达系统具有它自身的优势。例如，BEVS系统中外源基因的表达多数在病毒感染细胞的晚期，这时的细胞状态已经异常，往往致使表达产物不能得到有效的翻译后加工，从而导致表达产物的活性不高[15]。而通过昆虫转化细胞表达，整个过程没有病毒DNA的污染和病毒蛋白的表达，得到的稳定转化细胞系可以稳定传代培养，并且整个表达过程都是在细胞状态良好的情况下进行的，这样不仅使得产物的安全性大大提高，而且还可以使产物得到更加有效的加工，提高了产物的活性，如果借助无血清细胞培养和分泌表达技术，表达产物极易纯化，并且可以满足工业上的大规模培养要求。

目前转化昆虫细胞载体多是转座子载体和非转座子载体，其中包含有P转座子、mariner转座子、piggyBac等转座子，其中在昆虫个体及昆虫细胞中piggyBac转座子应用较为成熟。piggybac属于Ⅱ类可移动元件，首次从粉纹夜蛾Trichoplusia niTN-368细胞系中分离[16]，它已被广泛应用于转化昆虫细胞及转基因家蚕研究。李曦等[17]构建了pigA3GFP-IE-neo-FH-hGM-CSF-polyA–fib-L-intron1，然后转化家蚕BmN细胞，并通过G418筛选获得了稳定传代的转化BmN细胞系，不过外源基因表达水平不高；赵越等[8]构建了基于piggyBac转座子的载体，成功获得转基因家蚕并表达外源基因人胰岛素样生长因子(hIGF-Ⅰ)；薛仁宇等[18]同样构建了piggyBac转座子的载体，包含有新霉素抗性基因(neo)、gfp、hIGF-Ⅰ。

pIZT/V5-His是Invitrogen公司开发的一种能在昆虫Sf9细胞中稳定表达外源基因的非转座子载体，该载体利用黄杉毒蛾核型多角体病毒(Orgyia pseudotsugatanucleopolyhedrovirus，OpNPV)的ie-1和ie-2启动子分别控制Zeocin-GFP的融合表达与外源基因的表达，当构建好的重组质粒转染细胞后，通过一定浓度的博莱霉素筛选可获得稳定表达外源基因的细胞系。目前该载体已经广泛应用于各种外源基因的表达，Wang等[10]将鲎属的 C因子的基因克隆至载体pIZT/V5-His然后转染Sf9细胞，实现了该基因的稳定表达；孙延波等[11]构建重组载体pIZT/V5-His-mlL-4，转染 Sf9细胞，获得了稳定表达的细胞系；韩凤丽等[19]把对虾的酚氧化酶原基因克隆进入载体 pIZT/V5-His，然后诱导大肠杆菌BL21，使得酚氧化酶原基因成功表达。由此可以看出该载体可以在多种不同种类细胞中表达不同种类的蛋白。本研究中，hGM-CSF在BmN细胞中稳定表达表明OpNPV的ie-1启动子在家蚕BmN细胞中也具有活性，pIZT/V5-His可以用于在家蚕BmN细胞中表达外源基因，进一步可以推测该载体也有可能用于昆虫种系转化研究。

该载体转染时与piggybac不同，转化过程不需要辅助质粒，直接将重组的载体加脂质体配成转染液即可进行转染，并且随机插入宿主基因组，转染效率高，24 h之内即可看到绿色荧光细胞。Piggybac转座子一般在宿主基因组的TTAA处插入[13,18,20-22]，迄今为止还没有关于载体 pIZT/V5-His插入具有偏爱性的报道，该方面还需要进一步研究。从转染细胞荧光观察结果显示，不同转化细胞所表现的绿色荧光强度存在明显差异，这可能是gfp表达元件在不同细胞中的拷贝数不同或由于整合在细胞基因组的位置不同从而表达水平不同。由此可以推测，通过对外源DNA插入区域的基因序列分析，有可能会获得新的增强子或者沉默子。

BmN细胞大约 3 d传代 1次。本研究用质粒pIZT-IE-hGM-CSF转染BmN细胞，24 h后可观察到一小部分绿色荧光细胞，随着使用Zeocin抗生素的筛选，荧光细胞比例逐渐增加，从图2可看出，到1个月时荧光细胞可达 70%以上，我们在该基础上继续筛选至 2个月，绿色荧光细胞可以维持该比例稳定遗传。gfp在细胞传代大约10次后不但没有减弱，而且可以比较稳定地遗传。由此可以初步表明外源基因不是游离的，而是成功整合进了细胞的基因组内。

从本研究的Western blotting结果可以看出，转化细胞系在大约22 kDa处检测到特异性条带，而正常的BmN细胞样品则没有检测到，条带大小比大肠杆菌中表达的hGM-CSF的分子量(16.3 kDa)稍大，而与杆状病毒介导的hGM-CSF在BmN中表达的分子量是一致的，这可能是hGM-CSF产物在家蚕细胞中经过翻译后修饰的结果。这些结果说明外源基因hGM-CSF在转基因细胞中得到了成功表达，从而推测该载体也可用于转基因家蚕的研究。通过本研究中SDS-PAGE及ELISA的实验结果看出，hGM-CSF在BmN细胞中的表达水平很低，提高外源基因的表达水平仍是一个急需解决的问题。我们设想通过提高外源基因拷贝数，使用增强子增强外源基因的表达水平，筛选表达水平高的细胞克隆，并通过分泌表达等方法来提高外源基因的表达水平。

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Expression of hGM-CSF in transformed silkworm BmN cells mediated by non-transposon vector

Huimei Chen, Guangli Cao, Renyu Xue, and Chengliang Gong
College of Pre-clinical Medical and Biological Science, Soochow University, Suzhou 215123, China

Received:January 5, 2010;Accepted:April 9, 2010

Supported by:National Key Basic Research Program of China(973 Program)(No.2005CB121000), Key Fostering Projec for Application Research of Soochow University(No.Q3134991).

Corresponding author:Chengliang Gong.Tel/Fax: +86-512-65880183; E-mail: gongcl@suda.edu.cn国家重点基础研究发展计划项目(973计划)(No.2005CB121000)，苏州大学重大应用研究培育项目(No.Q3134991)资助。