小叶板蓝根抗病毒及抑菌效果比较研究

谢晓亮，尹晓琳，温春秀，刘灵娣

（1.河北省农林科学院药用植物研究中心，河北 石家庄 050051；2.河北医科大学基础医学学院，河北 石家庄 050071）

小叶板蓝根抗病毒及抑菌效果比较研究

谢晓亮1*，尹晓琳2，温春秀1，刘灵娣1

（1.河北省农林科学院药用植物研究中心，河北 石家庄 050051；2.河北医科大学基础医学学院，河北 石家庄 050071）

目的：明确不同板蓝根种质药效学差别，为板蓝根优良品种选育、生产栽培提供依据。方法：通过板蓝根不同种质水提液细胞毒试验、抗病毒试验、抑菌试验，进行抗病毒、抑菌效果比较。结果：小叶板蓝根对细胞的毒性作用、抗病毒作用以及对金黄色葡萄球菌的抑菌作用均明显优于大叶板蓝根，从药效学监督看小叶板蓝根可以作为板蓝根栽培的优良品种进行推广应用。

板蓝根；种质；抗病毒；抑菌；比较研究

板蓝根是我国传统常用中药材， 《中国药典》2010年版记载板蓝根为十字花科植物菘蓝Isatis indigoticaFort.的干燥根，别名北板蓝、大青根等，其叶为大青叶。板蓝根味苦，性寒，归心、胃经，具有清热解毒，凉血利咽的功能［1］，具有抗菌、抗病毒、抗内毒素、抗炎、增强免疫功能［2-3］、抗乙型肝炎［4］等多种作用。近年来的研究证实，板蓝根内含有多种抗病毒成分，对感冒病毒、腮腺炎病毒、肝炎病毒及流脑病毒等有较强的抑制和杀灭作用［5-8］，主治流行性感冒、流行性腮腺炎、乙型脑炎、传染性肝炎、咽喉肿痛等症［9-11］。它是板蓝根冲剂、板蓝根针剂、三九感冒灵、康必得等感冒和抗病毒类中成药的主要原料。在临床上常用板蓝根单味或与贯众、金银花、野菊花等合用以治疗感冒和流感等传染病及热性病。然而，板蓝根种质混杂，栽培类型较多。目前，安国等地大田生产的板蓝根有明显区别的两种类型，一是小叶菘蓝，习称北板蓝根（小叶板蓝根）；一是广泛栽培的大叶菘蓝（大叶板蓝根，普通栽培品）。本文针对目前安国等地种植生产的小叶板蓝根和大叶板蓝根进行了抑菌及抗病毒效果方面的比较研究，明确其药效学差别，为生产栽培提供依据。

1 材料

小叶板蓝根和对照大叶板蓝根均采自安国霍庄种植基地。取1年生秋季采收的根条，切成1 cm左右长的小块于60℃烘箱中过夜烘干至衡重，然后将其粉碎，取其粉末分别装袋编号，置干燥器中备用。

称取制备好的板蓝根粉末10 g，加蒸馏水80mL于100 mL烧杯中煮至沸腾，并继续煮沸水提15 min，室温下冷却后于 2 000 r·min－1下离心10 min，取上清液用5 mol·L－1NaOH水溶液调pH值至7.2，于100 mL容量瓶中定容得板蓝根水提制剂原液置4℃冰箱中备用。

病毒唑（上海通用药业股份有限公司第三公司）；1640培养液（GIBCO公司）；FBS（胎牛血清，杭州四季青生物工程有限公司）；庆大霉素（Sigma公司）；Hela细胞（中国科学院上海细胞库）；金黄色葡萄球菌ATCC26001（北京菌种保存中心）；MH血液琼脂培养基（自配）；呼吸道合胞病毒（RSV）（中国军事医学科学院）。

2 方法

2.1 药液配制

细胞维持液（2%FBS1640培养液）：98 mL 1640培养液、2mL FBS（胎牛血清）、0.125 mL庆大霉素（4万 U·mL－1），混匀过滤除菌备用。

病毒唑溶液配制：取病毒唑溶液（100 mg·mL－1）0.6 mL，加入0.6mL，混匀后用细胞维持液进行倍比稀释，稀释的终浓度分别为 1／4，1／8，1／16，1／32，1／64，1／128，1／256，1／512，1／1 024（即配即用）。

各种板蓝根制剂的配制：取定容后的板蓝根水提制剂原液0.6 mL，加入0.6 mL细胞维持液进行倍比稀释，得到终浓度为原液浓度的1／4，1／8，1／16，1／32，1／64，1／128，1／256，1／512，1／1 024的板蓝根水提制剂稀释液（即配即用）。

2.2 细胞毒试验

取出冻存的Hela细胞，立即放入37℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1 min内全部融化，以70%酒精擦拭保存管外部，移入无菌细胞培养瓶中，于37℃、5%CO2培养箱过夜培养。每2 d扩增1次细胞，当细胞培养足量时，将细胞稀释成1×106个·mL－1，分装至 24孔细胞培养板内，1 mL／孔，同样条件过夜培养。

将生长良好的24孔单层细胞培养板用无血清培养液洗涤1次细胞，然后加入各浓度板蓝根水提制剂稀释液及病毒唑，1 mL／孔，每个稀释度用两个孔，留细胞对照，置37℃、5%CO2培养箱培养48 h，通过显微镜下观察有无细胞病变来确定不同药物的细胞毒性。

2.3 抗病毒试验

将扩增好的RSV病毒液进行10倍系列稀释，取10－3和10－4两个浓度的病毒稀释液接种于新的生长良好的24孔细胞培养板内的单层Hela细胞中，每孔0.1 mL，每个稀释度接种2孔，37℃、5%CO2下孵育1 h，弃病毒液。

将2种板蓝根的水提制剂原液和病毒唑溶液（100 mg·mL－1）进行倍比稀释。取 1／64～1／1 024的5个稀释度进行病毒抑制试验，其中小叶板蓝根和大叶板蓝根从1／32开始，病毒唑从1／128开始稀释。将以上几种药液分别加入不同稀释度病毒吸附过的单层Hela细胞中，每个稀释度各加2孔，同时设病毒对照、细胞对照，置37℃、5%CO2下培养箱培养48 h，观察有无细胞病变。

2.4 抑菌试验

将金黄色葡萄球菌ATCC26001接种于M-H血液琼脂平板中，37℃普通培养箱培养18 h。

将金黄色葡萄球菌配制成105CFU·mL－1，接种于含药 1／2，1／4，1／8，1／16，1／32，1／64，1／128，1／256，1／512的液体 M-H培养基中，50μL／管，37℃下培养24 h，并设正常对照。

取培养后的各稀释度菌液做百倍稀释，得10－2，10－4，10－6，10－85个稀释度，再取百倍稀释的各稀释度菌液50μL，分别涂布在不含药液的M-H固体培养板上，培养18 h后观察结果。

菌落计数：菌落计数后，按 “细菌浓度＝菌落数／0.05 mL×稀释倍数”折算出各管细菌的浓度。

3 结果与分析

3.1 小叶板蓝根对细胞的毒性

24孔单层细胞培养板上生长良好的细胞经无血清培养液洗涤1次并加入各浓度板蓝根水提制剂稀释液及病毒唑后，在37℃、5%CO2培养箱培养48 h，然后在显微镜下观察有无细胞病变发生。未发生病变的细胞应为梭形，发生病变的细胞变为圆形或多形态性。结果以出现明显病变的稀释度（＋）为最高稀释度，见表1。由表1可以看出，对细胞产生毒性作用的最高稀释度：小叶板蓝根为1／32，大叶板蓝根为1／16，药物阳性对照（病毒唑）为1／64。显然各种板蓝根的细胞毒性与病毒唑相比均较弱，其中小叶板蓝根对细胞的毒性作用强于大叶板蓝根。

表1 小叶板蓝根的细胞毒试验比较

3.2 小叶板蓝根的抗病毒效果

将小叶板蓝根和对照大叶板蓝根的水提制剂原液和病毒唑溶液（100 mg·mL－1）进行2倍稀释。取1／64～1／1 024的5个稀释度进行病毒抑制试验，其中大叶板蓝根从1／32开始，病毒唑从1／128开始稀释。将以上几种药液分别加入10－3和10－4两种不同稀释度的病毒吸附过的单层Hela细胞中，同病毒对照和细胞对照一起，在37℃、5%CO2下培养48h后，显微镜下观察细胞发生病变的情况，确定细胞是否发生病变，病变的标准同前，观察结果见表2和表3。从中不难看出，当病毒稀释度为10－4时，药物抗病毒作用的最高稀释度：小叶板蓝根为1／512，大叶板蓝根为1／128，阳性对照（病毒唑）为1／256，可见在此病毒稀释度下，小叶板蓝根的抗病毒效果是大叶板蓝根的4倍；当病毒稀释度为10－3时，药物抗病毒作用的最高稀释度：小叶板蓝根为1／256，大叶板蓝根为1／32，阳性对照（病毒唑）为1／128。可见，在此病毒稀释度下，小叶板蓝根的抗病毒效果是大叶板蓝根的8倍，而且同样也是病毒唑的2倍。两种病毒稀释度的结果均表明，小叶板蓝根的抗病毒作用效果明显比大叶板蓝根强，且均强于病毒唑的抗病毒效果。

表2 小叶板蓝根抗病毒作用比较（RSV 10－4）

表3 小叶板蓝根抗病毒作用比较（RSV 10－3）

3.3 小叶板蓝根对金黄色葡萄球菌的抑菌作用

取培养后的各稀释度金黄色葡萄球菌菌液做百倍稀释，得 10－2，10－4，10－6，10－84个稀释度，再取百倍稀释的各稀释度菌液50μL，分别涂布在不含药液的M-H固体培养板上，经24 h培养后观察结果，并进行菌落计数，并计算出最终细菌浓度，见表4。经统计学分析，对金黄色葡萄球菌的抗菌作用，小叶板蓝根有 4个稀释度（1／16，1／8，1／4和1／2）表现明显的抑菌效果，而大叶板蓝根仅有3个稀释度（1／8，1／4和1／2）有明显抑菌效果。小叶板蓝根在稀释度为1／16时即表现抑菌作用，1／8浓度时作用变强，1／4和1／2浓度时抑菌作用同大叶板蓝根相比最为明显，特别是1／4稀释度下，小叶板蓝根的抑菌效果是大叶板蓝根的106，即100万倍。由此可见对金黄色葡萄球菌的抗菌作用，小叶板蓝根要明显强于大叶板蓝根。

表4 小叶板蓝根对金黄色葡萄球菌的抑菌作用比较

4 讨论

试验通过对小叶板蓝根与普通栽培种大叶板蓝根的细胞毒、抗病毒、抑菌效果比较研究表明，小叶板蓝根与大叶板蓝根的抗菌、抗病毒活性不同，这与刘云海等［10］、乔传卓等［11］的研究报道一致。本试验结果表明小叶板蓝根对细胞的毒性作用明显强于大叶板蓝根；小叶板蓝根的抗病毒作用效果明显比大叶板蓝根强；对金黄色葡萄球菌的抗菌作用，小叶板蓝根强于大叶板蓝根。从药效学角度看，小叶板蓝根可作为优良板蓝根种质进行推广应用。

表2和表3的抗病毒作用结果显示，小叶板蓝根的水提液与大叶板蓝根的水提液在两个病毒稀释度下的抗病毒表现趋势一致，当病毒稀释度为10－4时，药物抗病毒作用的最高稀释度：小叶板蓝根为1／512，大叶板蓝根为1／128，在此病毒稀释度下，小叶板蓝根的抗病毒效果是大叶板蓝根的4倍；当病毒稀释度为10－3时，药物抗病毒作用的最高稀释度：小叶板蓝根为1／256，大叶板蓝根为1／32，在此病毒稀释度下，小叶板蓝根的抗病毒效果是大叶板蓝根的8倍，也就是说，投入等量的药材量，小叶板蓝根的药效是大叶药效的4倍以上。

表4显示，小叶板蓝根对金黄色葡萄球菌的抗菌作用，其水提液稀释度由1／8变为1／16时，抗菌效果下降仅10倍左右，而由1／4变为1／8时则下降了近106即100万倍。而接下来由1／2变为1／4时抗菌效果则又仅仅下降了不到100倍。我们认为，水提液稀释度由1／2变为1／4时抗菌效果下降幅度的大幅度减小与试验溶液中金黄色葡萄球菌的浓度有关，并非是抗菌效果下降的幅度真的变小了，也就是说这种结果出现的真正原因可能是某种因素在起作用，本研究没有进行进一步的探讨。

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A Com parative Study on Effects of Antivirus and Bacteriostasis of Different Germ plasms of Isatidis Radix

Xie Xiaoliang1，Yin Xiaolin2，Wen Chunxiu1，Liu Lingdi1
（1.Research Center on Medicinal Plants Hebei Agriculture and Forestry Academy，Shijiazhuang Hebei050051，China；2.College of Basic Medicine HebeiMedical University，Shijiazhuang Hebei050071，China）

Objective：The pharmacodynamics differences in different germplasms of isatidis radix were studied to provide basis for the field production.Methods：The water extracts from the germplasms of isatidis radix were used in cytotoxicity test，antivirus and antibacterial tests.Results：It was found that toxicity to cells，antivirus and bacteriostasis effects toward golden staphylococci of small leaf isatidis radix were obviously stronger than those of the big leaf one，the small leaf one should be used in production as an improved variety of isatidis radix.

Isatidis radix；Germplasm；Antivirus；Bacteriostasis；Comparative study

*谢晓亮，E-mail：xie7652137＠126.com

2010-03-16）