六味地黄方超微饮片含药血清对大鼠前脂肪细胞的影响

肖子曾 ，赵 婧 ，戴 冰 *，冷 旺 ，梅 君 ，李兴丰

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学硕士研究生班，湖南 长沙 410007；3.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）

六味地黄方是临床疗效非常显著的滋阴补肾的经典名方，被后人誉为“补阴方药之祖”。近年来，对于六味地黄方体外试验的报道甚多，但对于该方的体内试验相对较少。六味地黄方被制成多种剂型，除了传统的丸剂及汤剂，还有颗粒剂和超微饮片。超微饮片作为一种新剂型，以其节省药材、方便卫生的特点已被众多患者所接受[1]，而对于六味地黄方超微饮片的体内作用如何，报道甚少。有研究表明口服六味地黄汤能明显降低实验性高血脂大鼠总胆固醇和肝中脂肪含量[2]，提示其对脂肪细胞的增殖、分化可能有一定影响。为观察六味地黄方超微饮片对脂肪细胞的增殖、分化究竟有无影响，现将实验方法及结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 20只健康Wistar大鼠，清洁级，雌雄各半，体质量 （200±20）g；由湖南中医药大学实验动物中心提供，合格证号:医动字第20-002号。

1.1.2 药物 六味地黄方超微饮片：熟地黄、山药、山茱萸、牡丹皮、泽泻、茯苓超微饮片 （湖南春光中药饮片公司，批号：050512）

1.1.3 试剂 地塞米松(批号 123K06612)，胰岛素(批号024K1188)，含酚红 DMEM低糖培养基(批号123K83031)，磷酸二羟丙酮(批号027K1635),上述试剂均购自Sigma公司；MTT(批号1313Bl1)购自Amresco公司；标准胎牛血清(批号20050617)购自兰州民海生物工程有限公司；油红0(批号830120)购自北京夏新试剂分装厂；DMSO购自宜兴市化工厂；双蒸水；其余试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 六味地黄方超微饮片灌胃溶液的制备 六味地黄方各单味药材超微饮片按比例 （熟地黄∶山茱萸∶山药∶丹皮∶泽泻∶茯苓=8∶4∶4∶3∶3∶3）混合共 75 g，加水至 450 mL 使其充分溶解，放置20 min后过滤，将滤液浓缩至含生药为2 g/mL。

1.2.2 动物分组及给药 将健康Wistar大鼠随机分为空白对照组、六味地黄方超微饮片2组，每组10只，雌雄各半，禁食12 h（自由饮水）。给予空白对照组生理盐水、六味地黄方超微饮片组按照每次30 g/kg（以生药材含量计）剂量（即1.5 mL/100 g。药物剂量按照60 kg成人体表面积换算），分别给予大鼠灌胃，1次/d，连续3 d。

1.2.3 空白及含药血清制备 上述各组大鼠于第3天最后1次灌胃1 h后,用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，经肝门静脉取血5 mL，静置4 h，1 500 r/min离心30 min，取上清液过0.22 μm微孔滤膜后用于实验。

1.2.4 大鼠前脂肪细胞的培养 取雄性大鼠腹股沟部纯净脂肪颗粒，pH 7.2缓冲生理盐水 (PBS)洗涤后剪成0.5～l mm3大小均匀的小颗粒，以1 000 r/min离心10 min取上层的纯脂肪颗粒，轻轻铺于经培养液润湿的培养瓶壁上。3～5 min后徐徐加入含20%胎牛血清的DMEM/低糖培养液5～10 mL，塞紧瓶塞，将底面翻转朝上。37℃、5%C02培养1～2 h，待粘附牢固后，翻转培养瓶做正常培养每日观察。原代培养区域性单层汇合达到约1/2瓶底面积后即可传代，取培养7代以内的大鼠前脂肪细胞用于实验[3]。

1.2.5 按马瑾瑜等[4]的方法测定 可见前脂肪细胞约在第2.5天时数量增加到20 000，在第9天前细胞基本呈现等比增长，其倍增时间约为2.5 d左右。

1.2.6 酶组织化学提取法测定大鼠前脂肪细胞分化过程中的标志物甘油磷酸脱氢酶(GPDH)动态变化 根据Stuart等[5]的方法进行测定，传代细胞形成单层汇合后，在胰岛素10 μmol/L和地塞米松1 μmol/L的作用下即开始上升并迅速增加，10 d左右到达高峰并维持在高水平。形态上表现为单层汇合1周后，细胞内出现大量脂滴。

1.2.7 油红O染色提取法测定脂肪细胞内脂肪含量 用PBS冲洗2～3次，加入10%的甲醛缓冲液室温下固定1 h，去固定液，加入油红O染色，室温下染色2 h，去染色剂，以无菌双蒸水冲洗2次，洗去未着色的染料，倒置显微镜下观察，照相。结束后，以异丙醇溶解，490 nm酶标仪下测吸光度，则可见前脂肪细胞内的脂肪含量在单层形成6～7 d后迅速增加，11 d左右到达高峰，与形态学上的单层汇合后1周左右细胞内出现脂肪颗粒完全吻合。细胞内脂肪含量的增加比GPDH的出现要晚约6 d左右。说明酶的出现在先，脂肪出现在后。

1.2.8 细胞分组及给药 将第四代的大鼠前脂肪细胞接种到96孔板，贴壁后于96孔培养板每6孔一组，分为4组：空白对照组（含10%空白大鼠血清），六味地黄方超微饮片含药血清高、中、低剂量组 （浓度分别为10%、5%、2.5%，简称超微高、中、低剂量组），上述各组所含血清的终浓度均为10%，含药血清含量不足者以空白大鼠血清补齐。

1.2.9 六味地黄方超微饮片对大鼠前脂肪细胞增殖的影响 配制大鼠前脂肪细胞增殖培养液:DMEM/低糖+空白大鼠血清,分别与六味地黄方超微饮片含药血清共同溶解于培养液中,其终浓度同“1.2.8”项。取第四代的大鼠前脂肪细胞以10 000个/孔接入96孔培养板中,37℃5%C02培养12 h，分别加入上述配制的各种含药培养液,再培养48 h，将浓度为5 g/L MTT液与10%空白大鼠血清的DMEM培养液按体积1∶9配成MTT培养液,移出培养液,换上MTT培养液培养4 h，吸干培养液,每孔加100 μL DMSO混匀后置酶标仪490 nm观测吸光度值,观察各浓度含药血清对前脂肪细胞增殖的影响，测定并记录各孔吸光度(A值)，6复孔取平均值。

1.2.10 六味地黄方超微饮片对大鼠前脂肪细胞分化过程中甘油磷酸脱氢酶(GPDH)的影响 配制大鼠前脂肪细胞分化培养液：DMEM/低糖+空白大鼠血清+胰岛素10 μmol/L+地塞米松1 μmol/L.以分化培养液配制不同浓度六味地黄方超微饮片含药血清培养液，其终浓度同“1.2.8”项。取第四代的细胞以30 000个/孔接种入96孔培养板中，37℃、5%CO2培养5 d，分别加入上述配制的各培养液，再培养5 d，培养结束后,酶组织化学提取法测定GPDH的活性，紫外分光光度计340 nm波长处观测吸光度值，实验以吸光度（A值）间接表示酶的活性，测定并记录各孔吸光度(A值)，6复孔取平均值。

1.2.11 六味地黄方超微饮片对大鼠前脂肪细胞分化过程中脂肪积聚的影响 取第四代的大鼠前脂肪细胞以30 000细胞/孔接种入96孔培养板中，于37℃、5%CO2培养10 d后，加入“1.2.10”配制好的含药培养液，再于同样条件下培养5 d，培养结束后,细胞用10%的甲醛固定1 h，用油红O工作液(2 g/L)染色2 h，用双蒸水充分洗净，培养板放入37℃温箱使残余水分蒸发，用异丙醇溶解细胞内油红O，置酶标仪510 nm观测吸光度(A值)，记录各孔吸光度(A值)，6复孔取平均值。

1.3 统计学分析

数据采用SPSS 14.0统计软件进行统计学分析。实验数据以“±s”表示，t检验。

2 结果

2.1 六味地黄方超微饮片对大鼠前脂肪细胞增殖、分化过程中甘油磷酸脱氢酶（GPDH）的影响

六味地黄方超微饮片含药血清对大鼠前脂肪细胞增殖的影响中10.0%、5.0%、2.5%浓度的六味地黄方超微饮片含药血清与空白血清比较，差异均有统计学意义 （P＜0.05）。六味地黄方超微饮片含药血清对大鼠前脂肪细胞分化过程GPDH的影响中10.0%、5.0%浓度的六味地黄方超微饮片含药血清与空白血清比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；2.5%的六味地黄方超微饮片含药血清与空白血清比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。提示六味地黄方超微饮片对大鼠前脂肪细胞增殖有促进作用，其它各组比较，其增殖A值随浓度增大而升高。对大鼠前脂肪细胞分化过程中GPDH的升高有抑制作用，且在高浓度时抑制作用最强。见表1。

表1 六味地黄方超微饮片含药血清对大鼠前脂肪细胞增殖、分化过程中GPDH的影响 （n=6，±s）

表1 六味地黄方超微饮片含药血清对大鼠前脂肪细胞增殖、分化过程中GPDH的影响 （n=6，±s）

注：与空白对照组比较△P＜0.05，△△P＜0.01。

组 别空白对照组超微高剂量组超微中剂量组超微低剂量组含药血清浓度（%）—10.0 5.0 2.5增殖(A值)0.22±0.031 0.42±0.056△△0.35±0.045△△0.28±0.044△分化GPDH(A值)0.55±0.093 0.35±0.074△△0.43±0.057△0.50±0.045

2.2 六味地黄方超微饮片对大鼠前脂肪细胞分化过程中脂肪积聚的影响

六味地黄方超微饮片含药血清对大鼠前脂肪细胞分化过程中脂肪积聚的影响中,10.0%、5.0%浓度的六味地黄方超微饮片含药血清与空白血清比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。提示六味地黄方超微饮片高、中剂量组对分化过程中脂肪积聚均有抑制作用，但低剂量组无此作用。见表 2。

表2 六味地黄方超微饮片含药血清对大鼠前脂肪细胞分化过程中脂肪积聚的影响 （n=6，±s）

表2 六味地黄方超微饮片含药血清对大鼠前脂肪细胞分化过程中脂肪积聚的影响 （n=6，±s）

注：与空白对照组比较△P＜0.05，△△P＜0.01。

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3 讨论

实验结果表明六味地黄方超微饮片对大鼠前脂肪细胞的增殖具有促进作用，对其分化过程中的脂肪分解具有抑制作用，从而减少游离脂肪酸的排放，减少脂肪颗粒的积聚，提示此作用可能为六味地黄丸治疗脂肪肝、糖尿病等代谢性疾病的机制之一。对研究六味地黄方在临床糖尿病、糖耐量异常、高血压、高血脂及动脉粥样硬化等代谢性疾病[5]的治疗机制有很好的促进作用。

中药超微饮片具有质量可控、安全有效、服用方便、节省药材的优势。中医超微饮片实施大规模工业化生产，为近年中药现代化研究的一个热点。本研究在参考有关方法的基础上，将单味药材超微饮片按比例混合，给大鼠灌胃，取其含药血清，以大鼠前脂肪细胞为研究对象，观察六味地黄方超微饮片含药血清对脂肪细胞增殖、分化的影响[6]。研究发现，该作用与药物的血清浓度高、低有关，但其机制如何？且与其汤、丸相比对脂肪细胞增殖、分化作用有何差异；同时该药物的含药血浆有无此作用，还有待进一步研究。

[1]蔡光先，杨永华.中药饮片改革的新探索-单味中药超微速溶饮片[J].湖南中医杂志，2001，17（6）:21-22.

[2]王秋娟.六味地黄煎剂研究：全丸及拆丸对小鼠耐缺氧与降血脂的作用[J].中国药科大学学报，1990，21(4)：241.

[3]朱晓海，何清濂.人前脂肪细胞培养及增殖与分化模型的建立[J].中华整形外科杂志，1999，15(3)：199-201.

[4]马瑾瑜，顾映红，余竹元.用快速比色计量法测定细胞生长[J].上海医科大学学报，1993，20（4）：309-311.

[5]Stuart J， SimPson J.Dehydr0genase enzyme cyt0chemistry 0f unfixed leucocytes[J].J C1in Path，1970，（23）：517-521.

[6]肖子曾，戴 冰，刘 磊，等.六味地黄丸对大鼠前脂肪细胞增殖与分化的影响[J].中国中医药信息杂志，2007，14（10）：22-24.